細胞培養(yǎng)標準操作程序(SOP)

1、細胞培育標準操作程序（SOP）1目的：為了保證培育細胞的正常生長，試驗技術人員必需明確并正確執(zhí)行細胞培育的基本操作步驟，特制訂試驗室細胞培育操作流程。2適用范圍：適用于來我院細胞室進行細胞培育工作的人員。3操作規(guī)程：3.1  培育液、PBS、胰蛋白酶的配制3.1.1  1000ml培育液的配制1、預備用品：培育粉、1000ml燒杯、玻棒、量筒、電子分析天平、PH儀、23天內的新穎三蒸水（或新穎反滲水）、NaHCO3粉、1000ml無菌玻璃瓶（100ml×10個玻璃瓶）、青霉素、鏈霉素、23個過濾器、注射器。紫外線照臺30min。2、將培育粉用900ml新

2、穎三蒸水（或新穎反滲水）溶解，并沖洗袋內殘留粉末。3、充分攪拌，按說明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g，Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等），再充分攪拌。無需加谷氨酰胺，因該培育基里已含有。4、用1M（1mol/L）HCl 調PH至7.0左右（細胞適宜在PH7.27.4生長，配制好后PH值會上升0.20.3，故配時調PH至7.0左右）。5、用新穎三蒸水（或新穎反滲水）定容到1000ml。6、配青霉素 80萬/瓶 + 4ml 蒸餾水 

3、0;      溶解 配鏈霉素100萬/瓶 + 4ml 蒸餾水      溶解  取0.5ml青霉素和0.4ml鏈霉素加入到1000ml培育液中，使其終濃度均為100U/ml，充分攪拌混勻。7、在無菌操作臺里用0.22um的除菌濾膜過濾配制好的培育液，并分裝到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，蓋上橡皮塞，放-20保存?zhèn)溆谩Ａ粢猓海?）配制培育液及調整培育液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新穎三蒸水（或新穎反滲水）配制。&

4、#160;    一般于配制當天制備，以保證水的純度和質量。（2）預備的100ml×10個玻璃瓶必需事先高壓滅菌！燒杯、量筒、玻棒、盛新穎三蒸水（或新穎反滲     水）的容器均不需高壓滅菌，潔凈即可。 3.1.2  PBS（平衡鹽溶液）的配制 NaCl 8g KCl 0.2g              新穎

5、三蒸水（或新穎反滲水）至1000ml Na2HPO4*H2O 1.56g KH2PO4 0.2g （1） 無需調PH值，其成分溶解后PH為7.4，不需除菌濾膜過濾除菌，放于4保存，用前直接高壓滅菌（高壓時，裝PBS的瓶子的瓶蓋要插針頭!）  （2） Na2HPO4*H2O 1.56g 則Na2HPO4*12 H2O需3.4888g （3） 如欲配制500ml，以上成分減半即可 3.1.3  0.25%胰蛋白酶的配制  

6、; 胰蛋白酶粉          2.5g   EDTA（乙二胺四乙酸二鈉） 0.3g   NaCl                     8.0g       

7、60;   KCl                        0.4g                        

8、;           +新穎三蒸水（或新穎反滲水）至1000ML  NaHCO3              0.5g   Glucose(葡萄糖) 1.0g   酚紅            

9、0;          0.06g（1）配出來的PH值為7.6，在PH值7.67.8范圍內，故不需調PH值。（2）用0.22um的除菌濾膜過濾分裝，瓶口用薄膜封口，放-20保存?zhèn)溆谩?可連續(xù)使用1月左右。（3）用于分裝的玻璃瓶必需事先高壓滅菌！而燒杯、量筒、玻棒、盛新穎三蒸水（或新穎反滲水）的容器均不需高壓滅菌，潔凈即可。（4）如欲配制500ml，以上成分減半即可 3.2  細胞復蘇1、預備：紫外線照臺30min，預備好裝有高壓滅菌好的吸管、試管的飯盒、廢液缸；培育基臨用前放

10、水浴箱里溫育20分鐘。在操作臺上擺放好物品，左邊為飯盒、培育液等，中間為酒精燈、試管架等，右邊放滴管架、鑷子，右上角放廢液缸。2、灼燒培育瓶口及瓶蓋，用滴管取培育基5ml加入試管中（一滴約為50ul）。3、戴手套，從-196液氮罐中取出凍存管，馬上放入37水浴箱中快速解凍，同時不斷輕輕搖動凍存管，保證凍存管內細胞1min內溶化。以70%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內。（慢凍快融）4、用吸細胞液的滴管從凍存管中完全吸出細胞懸液，加入到已裝有培育基的試管中，塞子塞試管，800rpm離心2min（用培育基且離心的目的:去除細胞冷凍愛護劑DMSO，因常溫下其對細胞毒性大），棄上清，試管底部的白色

11、物質為細胞，輕彈混勻。往試管中加培育基、FBS（胎牛血清）各80滴和20滴（使FBS濃度為20）。用吸細胞液的滴管輕輕吹打，使細胞混勻，以免在培育瓶里成團，影響細胞生長。5、將試管中的細胞懸液用吸細胞液的滴管全部吸出，加到培育瓶中，標記日期、細胞名稱，再把培育瓶放入CO2培育箱。（留意：加入到培育瓶后，培育瓶輕輕平放，用手拿培育瓶側壁，左右上下輕輕搖擺幾次，使細胞均勻貼壁在培育瓶底。）6、整理所用物品、用75%酒精噴灑操作臺，擦臺，保持臺面潔凈。 留意：（1）入細胞室前觀看CO2%壓力，5-7.5mPa左右，減壓器表壓力不低于0.1mPa?。?）剛復蘇的細胞需要的養(yǎng)分成分更多些，讓F

12、BS濃度達到20。（3）離心時間為12min，速度為800轉，不要離心太久，避開對細胞損害較大。（4）滴管使用留意事項：   a.吸細胞液專用一個滴管，各株細胞的滴管肯定要嚴格分開，不能混用，防止細胞間污染。   b.培育基和FBS（胎牛血清）可以用一個滴管，但分開用更好！   c. FBS（胎牛血清）不能和胰酶用一根滴管,由于血清對胰酶活性有抑制作用。   d胰酶和PBS（平衡鹽溶液）可以用一根滴管，不過最好分開（5）不是全部的細胞復蘇后都能活。死亡緣由：凍存時間太長（如2

13、年以上），技術不過關（如吹打太激烈）、細胞傳代數(shù)太多等。（6）關于PBS（平衡鹽溶液）:   a. PBS溶液配好后要高壓滅菌后才能用；PBS高壓時其瓶塞肯定要插針頭。   b. PBS和培育基都可以沖洗培育瓶里細胞中的雜質，但需用溫過的PBS沖洗細胞中的雜質。PBS雖然沖洗雜質效果較好，但它有使細胞易脫壁的傾向，故不行經常沖洗細胞。   c不溫的PBS用來做難消化細胞消化前沖洗一遍的預備，使細胞加入胰酶后易消化。   d消化后臨時不養(yǎng)細胞的培育瓶，可以往其中加入23ml PBS（防止

14、培育瓶干燥），培育瓶放CO2培育箱里短時間保存。下次用該培育瓶再養(yǎng)同種細胞時，把PBS吸出棄去，再用培育基沖洗一遍即可再用。（7）DMSO（二甲基亞砜）在常溫下對細胞毒性較大，而在4時，其毒性大大減弱，故凍存的細胞復蘇后應準時洗滌冷凍愛護劑DMSO（離心后棄去上清），防止DMSO在常溫下對細胞產生較大毒性！ 3.3  細胞換液1、倒置顯微鏡下觀看細胞生長狀態(tài)：a.移動細胞培育瓶時，觀看到呈漂移狀態(tài)的細胞為死細胞；b.生長狀態(tài)良好的細胞：透亮度大、折光性強、輪廓不清；能看清部分細胞微小結構，細胞處于對數(shù)生長期時可以見到很多分裂期細胞。c.生長狀態(tài)不良的細胞:

15、0;細胞折光性變弱，輪廓增加，胞質中常消滅空泡、脂滴、顆粒樣物質，細胞間空隙加大，細胞變得不規(guī)章，失去原有特點。d.只有生長狀態(tài)良好的細胞才適合進一步傳代和試驗。2、紫外線照臺30min，預備好吸管、試管飯盒，溫育培育基，F(xiàn)BS（胎牛血清）可不溫。試驗開頭時打開照明燈和抽風機，用75%酒精噴雙手。酒精燈點燃放中間。滴管放滴管架上，從左到右挨次為：吸細胞液的滴管、吸培育基的滴管、吸FBS（胎牛血清）的滴管。從水浴箱中取出培育基，擦干水放入操作臺的左邊。3、從CO2培育箱中取出細胞培育瓶，在酒精燈外焰上旋轉灼燒其瓶口、蓋子處（留意不要把膠蓋燒焦），滴管（前端90%部位）灼燒。細胞培育瓶傾斜，用吸細

16、胞液的滴管吸出舊液棄到廢液碗中，盡量吸潔凈。留意：滴管的膠頭應在瓶外壓緊再伸進培育瓶內，避開產生氣泡，且不要伸入瓶內太多，防止造成污染；滴管尖端懸空棄液，不要觸到廢液碗（要親眼看到棄液，防止滴管尖端觸到廢液碗）！4、用吸培育基的滴管吸取培育基90滴加入到培育瓶（25c）中，再用吸FBS（胎牛血清）的滴管吸取FBS 10滴加入到培育瓶中。（使FBS濃度為10）5、旋緊細胞培育瓶蓋后，再旋回半圈，以利于空氣流通。平放回CO2培育箱中。6、整理所用物品、用75%酒精噴灑操作臺，擦臺，保持臺面潔凈。 留意:（1）在打開培育基、FBS（胎牛血清）、培育瓶前后均需旋轉灼燒其瓶口和瓶蓋，嚴格留意無

17、菌操作。滅菌飯盒只能在無菌操作臺里打開。（2）鑷子每次使用前均需灼燒。裝FBS的瓶子瓶蓋小，用鑷子夾住蓋子灼燒后，再用其夾住瓶蓋蓋上；取其瓶蓋時也是用鑷子夾住瓶蓋取下蓋子。（3）滴管在第一次使用前也需灼燒。留意：除吸取細胞液的滴管外，其他滴管滴加液體時都要懸空滴加。已吸過液體的滴管在再次使用前決不能再灼燒！滴管千萬不能混用?。?）培育瓶口不要對著自己，不加試劑時要平放。（5）培育液以沒過細胞為宜。（6）細胞液顏色變黃，死細胞多時換液。不要求每天換液，簡潔增加污染機會。 3.4  細胞計數(shù)1、原理：（1）計算細胞數(shù)目用血球計數(shù)盤計數(shù)。（2）血球計數(shù)盤一般有二個cha

18、mbers，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內之細胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細胞數(shù)目。               細胞數(shù)/ml4大格細胞總數(shù)/ 4×104留意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計

19、算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。2、計數(shù)方法：(1) 75%酒精棉簽清潔蓋玻片及計數(shù)板，再用干紗布或棉簽再擦一遍，放好蓋玻片。(2) 用滴管從已經吹打混勻的細胞懸液中取一滴滴在計數(shù)板周邊，再用加樣槍吹打混勻該滴液體，從中吸取13ul至蓋玻片邊緣（留意不要溢出，不要有氣泡）。(3) 觀看計數(shù)：壓線的記左不記右，記上不登記；成團的細胞只記為1個；先用低倍鏡（紅色，4×）找出大位置，再用中倍鏡（黃色，10×）進行計數(shù)。細胞數(shù)/ml4大格細胞總數(shù)/ 4×104(4) 計數(shù)完畢用75%酒精棉簽擦蓋玻片及計數(shù)板，再用干

20、紗布（或干棉簽）擦一遍。 3.5  細胞傳代1、紫外線照臺30min，預備好細胞培育所需物品。2、取滅菌試管1支，配完全培育基（含10%FBS）3ml（培育基:FBS=54滴：6滴）。3、用吸細胞液的滴管吸棄舊液。4、胰酶消化：加入約1ml（20滴）胰酶到培育瓶里消化。胰酶鋪平培育瓶底為佳。倒置顯微鏡下觀看培育瓶內細胞，一旦發(fā)覺大量細胞胞質回縮，細胞間隙增大，但未脫離培育瓶底，馬上用吸細胞液的滴管吸出胰酶棄去，把細胞培育瓶放入CO2培育箱讓殘存的胰酶連續(xù)消化，（在37胰酶消化效果最佳）。5、每1min把培育瓶拿到倒置顯微鏡下觀看，當觀看到細胞變圓，透亮，細胞間隙明

21、顯增大時,用吸細胞液的滴管從試管中吸取事先配好的完全培育基3ml加入到培育瓶中終止消化。6、用吸細胞液的滴管輕柔吹打，保證培育瓶底的每個角落都吹打到，斜坡處不能忽視（可以把滴管卡在瓶口處吹打斜坡處。吹打時盡量避開產生氣泡，因其對細胞有損害；需輕柔吹打，用力吹打對細胞也有損害。新學者可固定每個角落包括斜坡處吹打5次，靠近瓶口端處的角落也要吹到），把培育瓶中全部細胞懸液用吸細胞液的滴管移入試管中，再用滴管吹打混勻細胞懸液。7、取一滴細胞懸液進行計數(shù)（此步驟是為了積累培育細胞的閱歷，觀看多少密度的細胞具體幾天可以長滿,待有閱歷后此步驟可以省略。如需進一步進行鋪板則肯定要計數(shù)?。?、傳代：不同細胞依據(jù)

22、細胞數(shù)量、生長快慢、難易等，一般依據(jù)1：5比例進行傳代。先用滴管吹打混勻3ml（60滴）細胞懸液，取12滴細胞懸液到培育瓶中，補足完全培育基（培育基:FBS=9:1）使液體總體積達到4ml，平放到CO2培育箱中連續(xù)培育。9、整理所用物品、用75%酒精噴灑操作臺，擦臺，保持臺面潔凈。 留意：（1）對于難消化的細胞（如Bxpc-3胰腺癌細胞）在用胰酶消化前，先用12ml（即2040滴，或12滴管）4 PBS沖洗一遍，較易消化的細胞不需要此步驟。（2）肯定要防止細胞過消化！因過消化，使細胞成團，不均勻，且對細胞損害很大，影響細胞貼壁和導致生長狀態(tài)差等。* 過消化特征：a

23、.在沒有加入完全培育基終止消化前就有成團細胞從培育瓶壁上脫落，胰酶里消滅很多懸浮物，為掉下來的細胞。b.培育瓶底板上本身為白茫茫（細胞貼壁生長），而過消化后細胞脫壁掉下來，則可見培育瓶底板有一片片空隙。（3）過消化的處理：不吸出胰酶，馬上加入3ml完全培育基終止消化后一并收集入試管中，經過800 rpm 離心3min，棄去上清（失活的胰酶、培育基、FBS）。細胞沉淀（白色沉淀物）在試管底，用手指輕彈打散細胞，重新加入適量完全培育基，混勻后放入培育瓶中連續(xù)培育。（4）在加入未經37溫育的胰酶（指僅為室溫）消化細胞時，即使細胞已經變圓，且透亮，用完全培育基終止消化后仍很難吹打下來。那是由

24、于胰酶的溫度不適宜；而應當把殘留有胰酶作用的培育瓶放到CO2培育箱中，放置5min,讓胰酶在其最佳溫度(37)下消化細胞。（5）把試管中細胞懸液轉移到培育瓶中時，每次滴管在試管中取液時都要輕柔吹打液體，以防止細胞成團不均，影響在培育瓶中生長。（6）用力吹打和氣泡產生對細胞都有損害，故應輕柔吹打并盡量削減氣泡產生。（7）吹打結束使細胞盡量分別成單個細胞為宜。（8）完全培育基為含有10FBS（胎牛血清）的培育液（基）。（9）小牛血清使用范圍：520%，10%最常用。血清可把握細胞生長速度，若想減慢細胞生長速度可削減血清濃度，反之亦然。對于剛復蘇的細胞需要的養(yǎng)分成分更多些，則血清用20%。（10）一

25、般25c培育瓶需培育液5ml，通常需90滴培育基+10滴胎牛血清（FBS），一滴液體體積為50ul,即20滴為1ml。（11）一般細胞生長鋪至瓶底約80%，則可傳代或用來做試驗，否則細胞進入生長平臺期進而缺少養(yǎng)分而狀態(tài)老化，不易用于后續(xù)試驗。 3.6  細胞鋪板（如12孔板）1、紫外線照臺30min，預備好細胞培育所需物品。2、在滅菌試管1中配完全培育基3ml（培育基:FBS=54滴：6滴）3、消化同前，留意防止過消化。吹打混勻計數(shù)，如為：8.0×10 5個/ml4、稀釋細胞懸液：依據(jù)閱歷，細胞密度0.8×10 5個/ml較

26、合理，因每孔需加培育液1ml，共需12ml,分2次，每次6ml（因試管體積有限，6ml即120滴），則配制細胞懸液： 8.0×10 5個/ml ×x ml = 0.8×10 5個/ml × 6ml，x=0.6ml 即   細胞原液： 0.6ml×20滴/ml=12滴完全培育基： 6ml-0.6ml=5.4ml （5.4×20滴=108滴）97滴培育基+ 11滴FBS故取12滴細胞懸液、108滴完全培育液加入試管中。用吸細胞液的滴管吹打混

27、勻細胞懸液。5、在超凈工作臺里打開細胞板，鋪板，留意無菌操作。每孔1ml(20滴)，分4次滴加，每次5滴，按挨次依次滴入。留意：每次從試管中吸細胞懸液時都應吹打以使細胞均勻！6、連續(xù)稀釋細胞懸液6ml，操作同前。7、加完之后，當心平穩(wěn)地將培育板放入培育箱內，靜置5min后，在顯微鏡下觀看細胞是否鋪均勻，如不均勻，將影響后續(xù)試驗，則需在細胞板內吹打混勻細胞：因孔內細胞懸液1ml，接受700ul槍吹打（不能用滴管，會刮花底面），可以輕輕抵著底面往各個方向吹打。留意：當心吹打，最好不要起氣泡，否則會導致細胞不均，且影響觀看。吹打后放倒置顯微鏡下觀看，若不夠均勻，連續(xù)吹打。將細胞板拿出操作臺時需蓋板蓋

28、，避開污染。8、吹打完畢后，當心將細胞板放CO2培育箱培育。（留意：拿細胞板避開晃動，最好直拿直放，不要推動移動，否則細胞簡潔成團。）9、清潔操作臺面，用75%酒精噴灑操作臺，擦臺。 留意：（1）若鋪96孔板，則需在96孔板四周一圈孔中加入PBS，防止干燥。              （2）各種不同規(guī)格板的鋪板細胞數(shù)量：  板型細胞密度（孔）體積/孔需細胞數(shù)吹打加樣槍頭6孔板  0.60.8×10

29、 5個/ml 2ml  4×10 41ml12孔板0.60.8×10 5個/ml1ml 68×10 4700ul24孔板0.81.0×10 5個/ml0.5ml45×10 4300ul96孔板  1.0×10 5個/ml   0.1ml     1×10 4 50ul 3.7  細胞凍存1、冷凍前一日前更換半量或全量培育基，觀看細胞生