自身免疫性神經(jīng)炎未修改

1、自身免疫性神經(jīng)炎大鼠周圍神經(jīng)病理及電生理變化研究摘要 目的 觀察自身免疫性神經(jīng)炎(EAN)大鼠周圍神經(jīng)的形態(tài)學(xué)及5電生理功能變化，為自身免疫性周圍神經(jīng)炎的臨床提供參考。方法 45 只 SD 大鼠，隨機分為 3 組：對照組、模型 1組、模型 2 組，模型組采用 SP26腹腔注射法誘導(dǎo)自身免疫性大鼠模型，分別于誘導(dǎo)造模后 14 天（模型 1 組）及 28 天（模型 2 組）電鏡觀察尾神經(jīng)的病理變化，并采用肌電圖誘發(fā)電位儀檢測運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MCV)、感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度(SCV)，采用放射免疫法檢測血清 TNF-、P55 的表達水平變化。結(jié)果 模型 1 組及模型 2 組MCV、SCV 低與對照組，模

2、型 2組 MCV、SCV 高于模型 1 組；模型 1 組及模型 2 組 TNF-、P55 表達水平高于對照組，模型2 組 TNF-、P55 表達水平高于模型 1 組，模型 1 組電鏡觀察可見尾神經(jīng)脫髓鞘，細胞變性壞死，第 28 天，神經(jīng)細胞形態(tài)較 14 天恢復(fù)，細胞5程序性凋亡。結(jié)論 EAN 大鼠早期存在著周圍神經(jīng)的脫髓鞘等急性免疫反應(yīng)損傷，在恢復(fù)期損傷仍持續(xù)存在，損傷方式以細胞凋亡為主。自身免疫性神經(jīng)炎；周圍神經(jīng)；細胞；病理；電生理Study to Pathology and Electrophysiology of Peripheral Nerve in Rats with Experim

3、entalAutoimmune Peripheral NeuritisAbstract Objective To observe the change in appearance and physiological function ofperipheral nerve in rats with experimental autoimmune peripheral neuritis(ENS),provide referencefor treatment and preclinical research on autoimmune peripheral neuritis.Methods 24 S

4、D ratswere randomly divided into control groups,first mgroups and second groups,mrats withENS were induced by linear injecting SP-26 in abdominal, pathological change wereobserved with electronmicroscope , motor nerve conduction velocity, sensory nerve conductionvelocity and delitescence electric po

5、tential wave amplitude in coccygeal nerve were weredetected,and lever of TNF-and P55 in serum were measured in 14th days(first mgroups)and 28th days (second groups).Results In comparitons with control groups, MCV and SCV waslower in first mgroups and second mgroups,incomparitons with first mgroups,M

6、CV and SCV was higher in second mgroups; In comparitons with control groups, the leverof TNF-and P55 was higher in first mgroups and second groups, in comparitions with fristgroups,the lever of TNF-and P55 was higher in second groups; demyelination of coccygeal28thnerve and necrosis of Schwann cell

7、were observed in first mgroups,and indays,appearance of cellula nervosa improved and Schwann cell appeared apoptosis.s acuteimmunologic injury occurred in nervus peripheralis of rats with ENS in morning,injury wascontinuous in convalescence stage,but main style of injury was apoptosis.Keywords exper

8、imental autoimmune peripheral neuritis; peripheral nerve; Schwann cell;peripheral; electrophysiology周圍神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫反應(yīng)引起神經(jīng)變性及功能改變是綜合癥、脊髓灰質(zhì)炎等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制之一，發(fā)病時周圍神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘及軸突會發(fā)生程序變，導(dǎo)致神經(jīng)功能下降甚至喪失，引起相關(guān)的靶的功能，嚴重者可引起，近年來，自身免疫反應(yīng)性神經(jīng)炎動物模型構(gòu)建，為自身免疫性神經(jīng)炎的研究奠定了基礎(chǔ)，并初步證實自身免疫性周圍神經(jīng)炎時周圍神經(jīng)炎細胞浸潤及脫髓鞘等免疫反應(yīng)相關(guān)性損傷細胞發(fā)生變形壞死等病理變化1，但發(fā)病不同時期

9、的序貫變化并不明確，我們通過 SP26 一次腹腔注射法構(gòu)建自身免疫性神經(jīng)炎大鼠模型，探討發(fā)病不同時期的大鼠周圍神經(jīng)髓鞘的細胞病理變化就及神經(jīng)的電生理變化，為自身免疫性周圍神經(jīng)炎的研究及臨床治療提供基礎(chǔ)。1 材料及方法1.1 試劑及儀器DANTEC Cantata 肌電圖誘發(fā)電位儀（丹麥 Dantec 公司），Hitachi H-600 透射電子顯（日立公司），深低溫冰箱（日立公司），DM 多管放射免疫計數(shù)器（上海精密儀器廠），戊二醛、磷酸鹽緩沖液（南京建成生物工程），乙酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛染色等（浙江碧云天生物試劑公司），TNF-檢測試劑盒、P55 檢測試劑盒（北京西塘生物試劑）。1.2 實驗動

10、物分組及模型構(gòu)建45 只 7-8 周齡清潔級 SD 大鼠，體重（100-150g），購自第四實驗動物中心，實驗動物證號（陜 20080174），實驗動物按隨機數(shù)字表法分為 3 組，空白對照組（15），模型 1 組（15），模型 2 組（15），自由飲水，定量飲食，分籠飼養(yǎng)，保持飼養(yǎng)室 26恒溫，適當光照，大鼠飼養(yǎng) 3 周適應(yīng)環(huán)境后采用 SP26 一次注射法構(gòu)建免疫性神經(jīng)炎模型，采用 SP26100g？腹腔注射，注射 7 天后，體重下降、尾爪無力、共濟失調(diào)等癥狀出現(xiàn)后，按 Conti 等模型構(gòu)建研究的標準評估，評估未達標者剔出實驗組。1.2 電生理檢測在模型構(gòu)建后第7天，分別對對照組及模型1組動

11、物進行周圍神經(jīng)電生理檢查，檢查前采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉動物，注射劑量300mg/kg，麻醉后動物固定于實驗臺，電生理檢查采用近神經(jīng)法，采用DANTEC Cantata肌電圖誘發(fā)電位儀測定各組大鼠尾神經(jīng)運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MCV)、感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度(SCV)及神經(jīng)動作電位波幅，MCV刺激電極置于尾遠端，電極位于其近側(cè)尾根部，相距14cm，參比電極位于其遠側(cè)1cm，接地電極位于刺激電極與電極之間，刺激強度3-6mA，MCV（m/s）=電極間距離/潛伏期×波幅, SCV測定方法同前，置換刺激電極與電極位置，刺激強度1-2 mA。在模型構(gòu)建后第14天測模型2組。1.3 標本及檢測大鼠電

12、生理檢測完畢后，無菌開胸，剪開心臟，采血4ml，離心后血型保存低溫冰箱，順行切開鼠尾部，鈍性分離，提取尾神經(jīng)，3%戊二醛中固定1小時，冰上固定30min。1.4 切片及染色標本應(yīng)用-4.0、PH值為7.4、濃度為1%的磷酸鹽緩沖液浸泡過夜，0.1%磷酸鹽緩沖液沖洗，鵝酸染色脫水，環(huán)氧樹脂封片，2m連續(xù)切片，乙酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛染色，HitachiH-600 透射電子顯觀察并照相。1.5 TNF-及P55檢測血清標本解溶后，采用放射免疫法檢測血清TNF-、P55表達水平，操作嚴格按照試劑及儀器使用說明書進行。1.6 統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)處理采用 SPSS11.5 軟件，統(tǒng)計學(xué)方法采用方差分析，組間

13、相關(guān)性檢驗采用pearson 分布，檢驗水準取 P<0.052. 結(jié)果2.1 電生理檢查結(jié)果同對照組相比，模型組神經(jīng)電傳導(dǎo)速度減慢，在造模后第 7 天，神經(jīng)傳導(dǎo)速度低于對照組，第 14 天，低于第 7 天，第 28 天，神經(jīng)傳導(dǎo)速度高于第 7 天及第 14 天，但低于對照組。表 1 三組大鼠 MCV、SCV 檢測結(jié)果比較組別NMCV（m/s）SCV(m/s)對照組1416.9±3.2620.4±3.927.6±1.489.9±1.52模型 1 組1213.2±1.9316.4±2.01模型 2 組10注：與對照組相比 P<

14、0.05，：與模型一組相比 P<0.052.2 血清 TNF-、P55 檢測結(jié)果時間？模型 1 組及模型 2 組血清 TNF-、P55 表達水平高于對照組，模型 2 組血清 TNF-表達水平高于模型 1 組，模型 1 組同模型 2 組 P55 表達水平無顯著差異。表 2.2 三組大鼠血清 TNF-、P55 檢測結(jié)果比較組別NTNF-pg/mlP55(pg/ml)對照組14176.9±32.632.5±7.65294.9±41.263.9±14.2模型 1 組12246.6±42.559.4±15.7模型 2 組10注：與對照組相

15、比 P<0.05，：與模型一組相比 P<0.052.3 周圍神經(jīng)電鏡觀察結(jié)果在 EAN 誘導(dǎo)后第 14 天，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)外膜細胞發(fā)生變形壞死，失去完整細胞結(jié)構(gòu)，壞死區(qū)結(jié)構(gòu)紊亂，在 ENI 誘導(dǎo)后第 28 天，細胞變性壞死減輕，但細胞凋亡等損傷存在。圖 1 對照組周圍神經(jīng)切片，電鏡下正常的圖 2 EAN 模型誘導(dǎo)后第 7 天，電鏡觀察細胞（形態(tài)完整）電鏡下壞死的細胞圖 3 EAN 模型誘導(dǎo)后第 28 天，神經(jīng)結(jié)構(gòu)未恢復(fù)正常，電鏡下細胞表現(xiàn)為固縮凋亡3 討論自身免疫性神經(jīng)炎(EAN)是一種周圍神經(jīng)系統(tǒng)病變，其與炎癥介質(zhì)及細胞因子介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)有關(guān)，腫瘤壞死因子（TNF）、CD

16、4+T細胞及巨噬細胞等的眾多細胞因子及炎性介質(zhì)與EAN的發(fā)病相關(guān)2，介質(zhì)及細胞因子通過改變Thl/Th2型細胞之間的平衡，上調(diào)Thl細胞的作用，激活增殖，導(dǎo)致T細胞免疫的失衡3.4。同時，淋巴細胞、巨噬細胞在周圍神經(jīng)系統(tǒng)、周圍集聚，穿過血神經(jīng)屏障作用于PNS（ ，）。同時，趨化因子高表達5，在趨化因子的作用下，巨噬細胞在局部浸潤，剝脫軸突髓磷脂層，導(dǎo)致髓鞘泡狀破裂，巨噬細胞吞噬完整的和受損的鞘磷脂，導(dǎo)致小靜脈周圍大部分軸突產(chǎn)生多發(fā)性脫髓鞘病變。周圍神經(jīng)的脫髓鞘是ENS的基本病理變化，細胞作為神經(jīng)軸突的主要組成部分，對于維持神經(jīng)的形態(tài)及功能具有重要的意義，在SP-26誘導(dǎo)的ENS大鼠可以發(fā)現(xiàn)，在

17、造模后14天觀察發(fā)現(xiàn)，電鏡下細胞發(fā)生變性壞死，細胞的細胞形態(tài)已不可見，局部為壞死組織填充，同時，對SCV、MCV的電生理功能檢測也發(fā)現(xiàn)，在造模后第14天，SCV、MCV的沖動傳導(dǎo)速率降低，說明神經(jīng)的電生理功能隨髓鞘的脫失發(fā)生變化，為進一步探討ENA的病理及電生理程序性變化，在造模后的28天，對上述指標的重復(fù)檢測發(fā)現(xiàn)，外周神經(jīng)的細胞的形態(tài)在第28天仍存在變化，但細胞變形壞死已不可見，部分細胞形態(tài)完整、細胞核固縮，表現(xiàn)為程序性細胞凋亡。神經(jīng)的電生理檢測結(jié)果表明，SCV、MCV的沖動傳導(dǎo)速率較14天時恢復(fù)，但仍未恢復(fù)正常，細胞作為軸突髓鞘的主要組成成分，在脫髓鞘病變過，既往的研究認為其對神經(jīng)功形態(tài)的

18、影響主要是神經(jīng)完整性的破壞，是免疫損傷的結(jié)果，但是近期的研究表明，在周圍神經(jīng)炎時，細胞能夠大量的生物活性物質(zhì)，參與ENS的周圍神經(jīng)損傷的病理過程，如細胞能夠以自方式調(diào)節(jié)致炎細胞因子或受體的6，表達介質(zhì)或增強對介質(zhì)的敏感性，在研究中對TNF-及其受體的P53的檢測也發(fā)現(xiàn)，在ENA過，TNF-及其可溶性受體P55在大鼠血清的表達水平明顯上調(diào)，在病理形態(tài)恢復(fù)期其表達水平也下降，同既往的TNF-水平同周圍神經(jīng)系統(tǒng)病變的預(yù)后相關(guān)一致，但P55下降的速度較慢，可能與TNF-的刺激持續(xù)存在有關(guān)，也可能同細胞對介質(zhì)及受體的調(diào)控功能有關(guān)，對ENA大鼠的電鏡病理、電生理及血清介質(zhì)的檢測結(jié)果說明，ENA的發(fā)病過，細胞的程序理變化對神經(jīng)的形態(tài)及電生理功能上的影響及對介質(zhì)的調(diào)控作用，是ENA共同的發(fā)病機制。參考文獻1，等.干擾素-對實驗性自身免疫性神經(jīng)炎治療作用的組織病理學(xué)和免疫學(xué)研究J.中國臨床神經(jīng)科學(xué),2006,l4(5):458-4632，治.實驗性自身免疫性神經(jīng)炎相關(guān)細胞的免疫機制J.中華神經(jīng)內(nèi)科雜志,2006，39（9）：629-6333 Zhu J，Deng GM，Levi M，et a1Prevention of experimental autoimmune neuritisby nasal administration of P2 protein peptid