蛋白質制備及含量測定(凱氏定氮法)

1、精品文檔實驗六蛋白質制備及含量測定微量凱氏（ Mirco-Kjeldahl）定氮法一、實驗目的要求1、了解蛋白質提取的一般方法和原理2、了解蛋白質含量測定的常用方法3、學習微量凱氏定氮法的原理4、掌握微量凱氏定氮法的操作技術，包括樣品的消化、蒸餾、滴定、含氮量的計算及蛋白質含量的換算等。二、實驗原理1、蛋白質的提取與制備蛋白質的提取與制備方法與生物材料的類型及蛋白質的存在部位有關。 如果是胞內蛋白， 首先必須要進行細胞破碎。 細胞破碎的方法與細胞的類型有關， 包括物理破碎（研磨、超聲波等） 、化學破碎（化學溶劑處理） 、酶法破碎等。如果是胞外蛋白，可以根據(jù)相應蛋白質的性質進行提取分離純化。如果

2、待提取的蛋白質是具有生物活性的蛋白質如酶，則在樣品處理、提取及分離純化過程中需注意防止蛋白質的變形失活，如在低溫下操作、 選擇適當?shù)木彌_體系等。2、蛋白質含量測定蛋白質含量測定的方法很多，如：紫外吸收法、雙縮脲法、考馬斯亮藍染色法（ Bradford 法）、 Folin 酚法、微量凱氏定氮法等。3、凱氏定氮生物材料的含氮量測定在生物化學研究中具有一定的意義，如蛋白質的含氮量約為16，測出含氮量則可推知蛋白含量。生物材料總氮量的測定，通常采用微量凱氏定氮法。 凱氏定氮法由于具有測定準確度高，可測定各種不同形態(tài)樣品等兩大優(yōu)點，因而被公認為是測定食品、飼料、種子、生物制品、藥品中蛋白質含量的標準分析

3、方法。其原理如下：（ 1）消化：有機物與濃硫酸共熱，使 有機氮 全部轉化為 無機氮 硫酸銨。為加快反應，添加硫酸銅和硫酸鉀的混合物； 前者為催化劑，后者可提高硫酸沸點。這一步約需 23h，視樣品的性質而定。天然的含氮有機物（如蛋白質，核酸及氨基酸等）與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫二元素被氧化成 二氧化碳和水 ；蛋白質分解，而有機氮則變成氨（無機氮），并進一步與硫酸作用生成硫酸銨。此時程稱之為“ 消化 ”。但是，這個反應進行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應的沸點，并加入硫酸銅作為催化劑， 以促進反應的進行。 甘氨酸的消化過程可表示如下：NH2-CH2 -COOH + 3H2SO4

4、NH3 + 2CO2+ 3SO2 + 4H2O2 NH3 + H 2SO4 (NH4) 2 SO4或 2 NH2-CH2 -COOH + 7H2SO4 (NH4) 2 SO4 + 4CO2+ 6 SO2 + 8H2O（ 2）加堿蒸餾：濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借水蒸汽將產生的氨蒸餾到一。1 歡迎下載精品文檔定量、一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中的氫離子結合，生成銨根離子。(NH4) 2 SO4 + 2NaOH Na 2SO4 + 2 NH3 +2H2ONH3 + H3 BO3 NH4H2 BO3或 2NH3 + 4H3BO3 (NH4) 2 B4O7 + 5H 2O

5、（ 3）滴定：硼酸吸收氨后， 氨與溶液中的氫離子結合， 生成銨離子， 使溶液中氫離子濃度降低。然后用標準無機酸滴定， 直至恢復溶液中原來氫離子濃度為止， 最后根據(jù)所用標準酸的當量數(shù)物質的量 （相當于待測物中氨的物質的量） 計算出待測物中的含氮量，再折算為粗蛋白含量。NH4H2BO3 + HCl NH4Cl + H 3 BO3或 (NH4) 2 B 4O7 + 2HCl + 5H 2O 2NH4Cl + 4H 3BO3滴定時用甲烯藍和甲基紅混合指示劑， 其指示范圍為 pH5.25.6 ，將 NH4H2BO3 的綠色滴至原來 H3 BO3的紫色即為終點。本法適用于 0.21.0mg（2.0 mg

6、）氮量測定。相對誤差應小于2%。圖 31 微量凱氏蒸餾裝置示意圖1. 熱源 2. 燒瓶 3. 玻璃管 4. 橡皮管 5玻璃杯 6. 棒狀玻塞 7. 反應室 8. 反應室外殼9.夾子 10.反應室中插管11.冷凝管 12.錐形瓶 13.石棉網。2 歡迎下載精品文檔圖 3 2 改進型微量凱氏定氮蒸餾裝置1. 水蒸氣發(fā)生器 2. 反應室 3. 水蒸氣排氣孔 4. 排水排氣孔 5外源水入口 6. 進樣口 7.加樣漏斗 8. 冷凝器 9. 冷凝器出口 10. 自來水入口 11. 通氣室 12. 通氣室出口 13. 通氣室出口 14. 排水柱 15. 排水柱入口 16. 排水柱入口 17. 冷凝水和廢水出

7、口三、主要實驗試劑和器材1、試劑（ 1）消化液（過氧化氫濃硫酸水 321）（ 2）硫酸鉀硫酸銅混合物：硫酸鉀與硫酸銅（ CuSO4· 5H2O）以 3：1（W/W）的配比混合研磨成粉末。（ 3） 30%氫氧化鈉溶液（ 4） 2%硼酸（ 5）混合指示劑（田氏指示劑）的配制：方法一：取 50mL0.1%甲烯藍無水醇溶液與 200mL0.1%甲基紅無水乙醇溶液混合配成，貯于棕色瓶備用，這種指示劑酸性時為紫色，堿性時為綠色，變色范圍窄且靈敏。或方法二： 0.1%溴甲酚綠乙醇溶液10mL與 0.1%甲基紅乙醇溶液2mL混和即成。本指示劑的變色范圍為pH 5.2 5.4 5.6紫紅色灰色綠色（

8、6） 0.0100 mol ·L-1 HCl （7）硼酸指示劑混合液：取 100mL2%硼酸溶液，滴加混合指示劑貯備液，搖勻后溶液呈現(xiàn)紫紅色即可。 （約加 1mL 左右混合指示劑） 2、待測樣品市售面粉。3 歡迎下載精品文檔3、主要器材（1） 分析天平（2）凱氏燒瓶 100mL（× 2）（3） 容量瓶（ 50mL）（4） 刻度吸管（ 1mL、2mL）（5）凱氏定氮蒸餾裝置（6）微量滴定管（ 3mL、5mL，可讀至 0.02mL）（7）錐形瓶（ 50100mL）四、操作方法1、樣品處理液體樣品（如血清）可以直接消化，而固體樣品中的含氮量是 100 克該物質（干重中所含氮的克數(shù)

9、）來表示（ %）。 因此在定氮前，應將固體樣品中的水份除掉。一般樣品干燥的溫度都采用 105，因為非游離的水都不能在 100以下烘干。在稱量瓶中稱入一定量的 面粉樣品，然后置 105的烘箱內干燥 4 小時。用坩堝將稱量瓶放入干燥器內， 待降至室溫后稱重， 按上述操作繼續(xù)烘干樣品。 每干燥 1 小時后，稱量一次，直到兩次稱量的數(shù)量不變，即達恒重（±0.0002g ）。精確稱取 0.1g 左右的干燥面粉作為本次實驗的樣品。2、消化取 2 個 100 毫升的凱氏燒瓶，向第一號燒瓶內加 0.1g 面粉樣品。注意，加樣品時應直接送至燒瓶底部， 切勿沾于瓶口或瓶頸上， 向 2 號燒瓶加入 0.1

10、 毫升蒸餾水作空白對照。在每個燒瓶內加入硫酸鉀硫酸銅混合物約 0.2g ，消化液（濃硫酸） 5mL，玻璃珠 1 粒，搖勻。將燒瓶約 60 度角固定在鐵架上，每個瓶口放一小漏斗，在通風廚內的電爐上消化。在消化開始時，應控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶內水汽蒸完，硫酸開始分解并放出 SO2 白煙后，適當加強火力， 使瓶內液體微微沸騰， 大約維持 2 3h 繼續(xù)消化（待消化液變成褐色后，為了加速完成消化，可將燒瓶取下，稍冷，將 30過氧化氫溶液 1 2 滴加到燒瓶底部消化液中，再繼續(xù)消化，直到消化液由淡黃色變成透明淡藍綠色，消化即告完成） 。直至消化液呈透明綠色為止。消化完畢，待燒瓶內容物冷卻后，

11、加蒸餾水 10 毫升（注意慢加，邊加邊搖） 。冷卻后將瓶內容物轉入 50 毫升的容量瓶中，并用蒸餾水洗燒瓶數(shù)次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度搖勻，做上記號備用。注意事項（ 1）小心加樣，切勿使樣品沾污凱氏燒瓶口部、頸部。（ 2）消化時，須斜放凱氏燒瓶（ 45°左右）?；鹆ο刃『蟠螅苊夂谏餅R到瓶口、瓶頸壁上。本次實驗 消化液已經制備好 ，備用。從蒸餾開始做。3、蒸餾（ 1）凱氏定氮裝置的安裝：首先固定主體（蒸汽發(fā)生器和反應室） ，高度適合于熱源加熱；然后用橡皮管將各相應部位連接， 放上自由夾； 最后長橡皮管連接自來水和出水口。4 歡迎下載精品文檔（ 2）蒸餾器的洗滌：儀器

12、應先經一般洗滌，再經水蒸氣洗滌。洗滌方法 ：蒸氣發(fā)生器中加入一定量水 （以排水高度為宜） 加熱燒開（注意：熱源切勿靠近橡皮管，防止將橡皮管燒化 ）。向反應室中加入蒸餾水，水即自動吸出（虹吸）；或移開蒸汽發(fā)生器的熱源片刻；或打開自由夾，使得冷水進入蒸汽發(fā)生器， 都可使反應室中的水自動吸出 （如果幾種措施都無效， 檢查裝置本身是否有問題如存在裂痕等） 。反復清洗 3 5 次。檢驗是否洗滌干凈 ：將一只盛有 5mL 2硼酸液和 1 2 滴指示劑的錐形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液體中，蒸餾數(shù)分鐘，如硼酸液顏色不變，表明儀器已洗凈。否則繼續(xù)洗滌直至洗凈為止。 （3）滴定標準樣品：標準硫酸銨溶液先

13、用標準硫酸銨溶液（0.3 毫克氮 / 毫升）試驗 23 次。蒸餾器洗凈后，開放水龍頭，使水進入蒸汽發(fā)生器，水放至球部即可。取 3 個 50 毫升的錐形瓶，各準確加入10 毫升硼酸（內加有混合指示劑） 。用表面皿復蓋備用。加樣：用吸量管吸取1mL 標準硫酸銨溶液，細心地由加樣漏斗傾入反應室，再用蒸餾水 1 毫升清洗漏斗。 取一個盛有硼酸混合指示劑的錐形瓶，置于冷凝管下端， 使冷凝器管口下端浸沒在硼酸溶液液面下，用量筒從漏斗加入30%氫氧化鈉 8mL，隨即將自由夾夾緊，并往漏斗加入少量蒸餾水封閉。蒸餾：用酒精燈加熱（應用擋風板將燈圍攏，維持火力恒定），沸騰不可高于虹吸管口以免整齊發(fā)生器溶液從虹吸管

14、倒吸，待第一滴蒸餾液從冷凝柱下端滴下時起，繼續(xù)蒸餾5分鐘， 然后將錐形瓶放低，使導管離開液面再蒸2 分鐘， 并用少量蒸餾水冷凝管口外壁，蒸餾完畢，取下錐形瓶，隨即將蒸餾器洗凈。（ 3）樣品消化液及空白的蒸餾取 50mL 錐形瓶數(shù)個，各加 5mL 2硼酸溶液和 1 2 滴指示劑，用表面皿覆蓋備用。用吸量管分別吸取 5mL/10mL樣品消化液按上述操作步驟進行蒸餾。a. 首先關閉冷凝水，打開自由夾 2，使蒸汽發(fā)生器與大氣相通。將錐形瓶放在冷凝器下端，浸沒于液面下。b. 移取 5mL/10mL樣品消化液小心加入反應室。 將準備好的 30%氫氧化鈉 8mL加入，關閉自由夾1，加水封。c. 關閉自由夾

15、2，打開冷凝水（不要過猛）d. 加熱蒸汽發(fā)生器，開始蒸餾。當觀察到錐形瓶中由紫色綠色 （ 2 3min），蒸餾 3min。放低錐形瓶，繼續(xù)蒸餾 1min，用少量蒸餾水洗滌冷凝管下端外側。取下錐形瓶，以表面皿覆蓋。以備滴定。蒸餾完畢，應立即洗滌反應室，方法同前，清洗35 次。繼續(xù)進行10mL空白消化液蒸餾。蒸餾全部結束后，將反應室清洗干凈，廢水排出。（ 4）滴定：蒸餾完畢，分別用 0.0100mol · L-1 標準鹽酸溶液滴定樣品消化液蒸餾的錐形瓶內溶液和空白消化液蒸餾的錐形瓶內溶液至綠色變?yōu)榈仙?記錄所用鹽酸的量，分別為 V1 和 V2。注意事項（ 1）必須仔細檢查凱氏定氮儀的

16、各個連接處，保證不漏氣。（ 2）凱氏定氮儀必須事先反復清洗，保證潔凈。5 歡迎下載精品文檔（ 3）蒸餾時，小心加入消化液。 加樣時最好將火力擰小或撤去 或將蒸汽發(fā)生器與大氣相通，避免加入的消化樣液發(fā)生倒吸。蒸餾時，切忌火力不穩(wěn)，否則也將發(fā)生倒吸現(xiàn)象。（ 4）蒸餾后應及時清洗定氮儀。（ 5）凱氏法的優(yōu)點是適用范圍廣，可用于動植物的各種組織，器官及食品等成組復雜樣品的測定，只要細心操作都能得到精確的結果。 其缺點是操作比較復雜，含有大量堿性氨基酸的蛋白質測定結果偏高。（ 6）普通實驗室中的空氣中常含有少量的氨、 CO2，會影響結果，所以操作應在單獨潔凈的房間中進行，并盡可能快地對硼酸吸收液進行滴定

17、。（ 7）微量滴定管的使用：清洗干凈，用 HCl 標準溶液潤洗；滴定時，小心操作，切勿滴定過快，尤其是滴定空白樣時，因為 HCl 消耗量可能很小。五、實驗結果與分析cHCl（ V1 V2）× 0.014 × 100消化液總量樣品的總氮量（克氮）×w測定時用量若測定的樣品含氮量部分只是蛋白質， （如血清）則：樣品的總蛋白含量（克蛋白 %）總氮量× 6.25 若樣品中除有蛋白外，尚有其他含氮物質，則樣品蛋白質含量的測定要更復雜一些。首先需向樣品中加入三氯乙酸（沉淀蛋白質） ，使其最終濃度為 5%，然后測定未加三氯乙酸的樣品及加入三氯乙酸后的樣品的上清液中的含氮量， 從而計算