PCR常見問題分析及對(duì)策

1、PCR常見問題分析及對(duì)策(無擴(kuò)增產(chǎn)物、非特異性擴(kuò)增、拖尾、假陽(yáng)性)問題1：無擴(kuò)增產(chǎn)物 現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無 原因: 1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer對(duì)樣品不合適 3.引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解 4.反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短 對(duì)策: 1.純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更換Buffer或調(diào)整濃度 3.重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物 4.降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間 問題2：非特異性擴(kuò)增 現(xiàn)象：條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致或者非特異性擴(kuò)增帶 原因： 1.引物特異性差 2.模板或引物濃度過高 3.酶量過多 4.Mg2+

2、濃度偏高 5.退火溫度偏低 6.循環(huán)次數(shù)過多 對(duì)策： 1.重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR 2.適當(dāng)降低模板或引物濃度 3.適當(dāng)減少酶量 4.降低鎂離子濃度 5.適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法 6.減少循環(huán)次數(shù) 問題3：拖尾 現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。 原因： 1.模板不純 2.Buffer不合適 3.退火溫度偏低 4.酶量過多 5.dNTP、Mg 2+濃度偏高 6.循環(huán)次數(shù)過多 對(duì)策： 1.純化模板 2.更換Buffer 3.適當(dāng)提高退火溫度 4.適量用酶 5.適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度 6.減少循環(huán)次數(shù) 問題4：假陽(yáng)性 現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物 原因： 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)

3、物 的交*污染 對(duì)策： 1.操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外； 2.除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管 及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。 3.各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間 一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。 假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶 PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及， PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。 模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板

4、時(shí)丟失過多，或吸入酚。模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單 位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂

5、糖凝膠電泳，一定要有 引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條 帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條 亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融 或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不 夠，引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。 反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，

6、應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。 物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出 現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影 響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下 擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。 靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。 假陽(yáng)性 出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增

7、條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。 引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增 時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng) 性。需重新設(shè)計(jì)引物。 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交 叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止 將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或 器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本 前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污

8、 染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò) 增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增

9、加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93變性，65左右退火與延伸)。 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。 克隆PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？ 最佳插入片段：載體比需實(shí)驗(yàn)確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行。應(yīng)測(cè)定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶

10、，插入片段共10ul。室溫保溫1小時(shí)，或4oC過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會(huì)自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小時(shí)能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需4oC過夜。 PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？ 如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會(huì)產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。 如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對(duì)照實(shí)驗(yàn)？ A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。 B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù)，

11、測(cè)定轉(zhuǎn)化效率。例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉(zhuǎn)化率為：1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。 C）如用p

12、GEM-T正對(duì)照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生20-40藍(lán)斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無核酸酶污染，不應(yīng)用其它來源的T4 DNA連接酶替換。 D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對(duì)照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實(shí)驗(yàn)步驟，可得100個(gè)菌落，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生20-40藍(lán)斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。 對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問題？ A）連接用室溫保溫1小時(shí)，能滿足大

13、多數(shù)克隆，為提高效率，需4oC過夜。 B）插入片段帶有污染，使3-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM-T正對(duì)照混合，再連接。如降低了對(duì)照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3-T缺失。 C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時(shí)有發(fā)生。UV過度照射會(huì)產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。 D）帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-

14、T pGEM-T Easy載體技術(shù)資料（TM042）。 E）高度重復(fù)序列可能會(huì)不穩(wěn)定，在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細(xì)胞PCR疑難解答當(dāng)PCR結(jié)果不甚滿意時(shí)，首先檢查以下幾方面并遵照?qǐng)?zhí)行： 將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼。 當(dāng)酶反應(yīng)混合物以70“熱啟動(dòng)”開始循環(huán)時(shí)，切記在加入酶后稍微振蕩一下，因?yàn)樵?.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱。 不要隨意減少dNTP的用量，它是一個(gè)系統(tǒng)的因素，必須與其它成份保持平衡。 對(duì)于有問題的PCR反應(yīng)，例如模板的量少，模板不純和環(huán)狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進(jìn)行預(yù)變性，后加模板進(jìn)行正常PC

15、R擴(kuò)增。 沒有擴(kuò)增產(chǎn)物： 在提供MgCl2緩沖液中，以0.25mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；無MgCl2的緩沖液以0.5 mmol/L為梯度增加MgCl2濃度。 泳道中出現(xiàn)模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA，則按上述提示濃度補(bǔ)加MgCl2，因?yàn)樵赑CR反應(yīng)中可能缺少游離的Mg2+。 檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。 檢查模板和引物的用量。 增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用量。 泳道中出現(xiàn)模糊條帶： 減少循環(huán)次數(shù)或模板DNA的用量。 提高退火溫度，但不要超過68。 重新設(shè)計(jì)引物或設(shè)計(jì)更長(zhǎng)的引物。 其他值得注意的條件： 建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92時(shí)不

16、能有效地使模板變性。 最佳反應(yīng)體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對(duì)蓋子加熱的PCR儀可以不加）。 大多數(shù)反應(yīng)中，0.75ml（0.51ml）的酶量在大多數(shù)情況下可以得到滿意的結(jié)果。 建議使用1.75mmol/L MgCl2350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2500mmol/L dNTP組合的混合物。然而要得到最佳結(jié)果，優(yōu)化Mg2+的濃度是必需的。 基因組DNA模板的質(zhì)量顯著影響PCR反應(yīng)。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè)DNA的長(zhǎng)度。DNA片段長(zhǎng)度可以超過50kb，傳統(tǒng)的基因組DNA能擴(kuò)增片段至10kb。 要擴(kuò)增更長(zhǎng)的片段應(yīng)使用超純或高分子量的DNA。請(qǐng)查閱高

17、分子量DNA提取操作過程相關(guān)文獻(xiàn)。 降低二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性。進(jìn)行長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增時(shí)，引物長(zhǎng)度一般為2434個(gè)核苷酸，溶點(diǎn)在6068間。使用這類引物可提高PCR反應(yīng)的退火溫度來增加反應(yīng)的特異性。這點(diǎn)非常重要，長(zhǎng)片段擴(kuò)增的效果往往受到非特異性短片段優(yōu)先擴(kuò)增的影響。 變性：第一步變性在94下進(jìn)行2分鐘。在循環(huán)過程中盡可能縮短變性時(shí)間（94下進(jìn)行20-30秒），除非模板中富含GC，則95下變性30秒。這可以防止DNA脫嘌啉和鏈斷裂，對(duì)于所需擴(kuò)增的基因組DNA片段終長(zhǎng)度超過12 kb時(shí)，應(yīng)該盡可能的降低變性溫度。 延伸：68-72下進(jìn)行延伸操作。 循環(huán)延伸：盡量采用循環(huán)延伸的條件，若PCR

18、儀無此功能，則必須增加延伸的時(shí)間，例如在擴(kuò)增10kb片斷時(shí)，延伸時(shí)間用10分鐘替代原來的8分鐘。 長(zhǎng)片斷PCR系統(tǒng)擴(kuò)增的片斷其3-末端帶有一個(gè)突出的A，因此建議采用T/A克隆。若要進(jìn)行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補(bǔ)平后再進(jìn)行。 測(cè)序時(shí)因酶的混合物帶有35外切酶活性，用Sanger方法進(jìn)行測(cè)序不能產(chǎn)生均一的（染色體）帶型。 引物設(shè)計(jì)： 一般長(zhǎng)度20-30bp； 至少50%的GC含量； 避免引物二聚體和二級(jí)結(jié)構(gòu)； 引物對(duì)的Tm值應(yīng)該接近。 也可下列圖示提示找到解決問題的突破口：PCR實(shí)驗(yàn)操作程序1. 在無菌的0.5ml或0.2ml離心管中按下列操作程序加樣：反應(yīng)物

19、加樣順序 體積(l) 終濃度去離子水 1 29.410Buffer B 2 5 14dNTP混合物 3 5 各200mol/L MgCl2 4 3 1.5mmol/L有義引物 5 2.6 0.25mol/L反義引物 6 2.6 0.25mol/L模板 7 2 0.1gTaqDNA聚合酶 8 0.4 1unit2.用微量可調(diào)加樣器和一次性Tip向每一管中加50l礦物油。每加一管換一次Tip。3.振蕩每只管，然后短暫離心。4.將管放到預(yù)熱的熱循環(huán)中，按下列程序開始循環(huán)：預(yù)變性 94 4分鐘 1次變性 94 1分鐘退火 37-65 1分鐘延伸 72 1分鐘循環(huán)30次終延伸 72 7分鐘 1次保存 4

20、 5.將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析結(jié)果。電泳條件：60-80V,15-20分鐘。6.紫外分析儀檢查電泳結(jié)果。四、討論1.假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量，PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板：模板中含有Taq酶抑制劑，在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，有可能是模板核酸提取過程出了毛病，可使用陽(yáng)性對(duì)照的DNA模板配合檢查模板質(zhì)量。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度

21、是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PC

22、R擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul、或100ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率，退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下 擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火

23、和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。2.假陽(yáng)性出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增 時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管

24、外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。3.出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和

25、量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93變性，65左右退火與延伸)。4.出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。PCR常見問題的精辟總結(jié)-耶魯大學(xué)Troubleshoot

26、ing for PCR and multiplex PCR Troubleshooting discussion is based on the PCR protocol as described in the table below. All reactions are run for 30 cycles.COMPONENTVOLUMEFINAL CONCENTRATION1.autoclaved ultra-filtered water (pH 7.0)20.7L- 2.10x PCR Buffer*2.5L1x3.dNTPs mix (25 mM each nucleotide)0.2L

27、200 M (each nucleotide)4.primer mix (25 pmoles/L each primer)0.4L0.4 M (each primer)5.Taq DNA polymerase (native enzyme)0.2L1 Unit/25 L6.genomic DNA template (100 ng/L)1.0L100 ng/25 L* The 10x PCR buffer contains: 500 mM KCl; 100 mM Tris-HCl (pH 8.3); 15 mM MgCl2 (the final concentrations of these i

28、ngredients in the PCR mix are: 50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl; 1.5 mM MgCl2). QUESTIONS SOLUTIONS 1. I get (many) longer unspecific products. What can I do? Decrease annealing timeIncrease annealing temperatureDecrease extension timeDecrease extension temperature to 62-68 CIncrease KCl (buffer) concentra

29、tion to 1.2x-2x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mM.Increase MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constant.Take less primerTake less DNA templateTake less Taq polymeraseIf none of the above works: check the primer for repetitive sequences (BLAST align the sequence with

30、 the databases) and change the primer(s)Combine some/all of the above 2. I get (many) shorter unspecific products. What can I do? Increase annealing temperatureIncrease annealing timeIncrease extension timeIncrease extension temperature to 74-78 CDecrease KCl (buffer) concentration to 0.7-0.8x, but

31、keep MgCl2 concentration at 1.5-2mMIncrease MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constantTake less primerTake less DNA templateTake less Taq polymeraseIf none of the above works: check the primer for repetitive sequences (BLAST align the sequence with the databases) and cha

32、nge the primer(s)Combine some/all of the above 3. Reaction was working before, but now I cant get any product. Make sure all PCR ingredients are taken in the reaction (buffer, template, Taq, etc)Change the dNTP solution (very sensitive to cycles of thawing and freezing, especially in multiplex PCR)I

33、f you just bought new primers, check for their reliability (bad primer synthesis ?)Increase primer amountIncrease template amountDecrease annealing temperature by 6-10 C and check if you get any product. If you dont, check all your PCR ingredients. If you do get products (including unspecific ones)

34、reaction conditions as described above.Combine some/all of the above 4. My PCR product is weak. Is there a way to increase the yield? Gradually decrease the annealing temperature to the lowest possible.Increase the amount of PCR primerIncrease the amount of DNA templateIncrease the amount of Taq pol

35、ymeraseChange buffer (KCl) concentration (higher if product is lower than 1000bp or lower if product is higher than 1000bp)Add adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 g/L final concentration). You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSO or glycerol.Check primer sequences for mismatches and/or i

36、ncrease the primer length by 5 nucleotidesCombine some/all of the above 5. My two primers have very different melting temperatures (Tm) but I cannot change their locus. What can I do to improve PCR amplification? An easy solution is to increase the length of the primer with low Tm. If you need to ke

37、ep the size of the product constant, add a few bases at the 3 end. If size is not a concern, add a few bases at either the 3 or the 5 end of that primer. 6. I have a number of primer pairs I would like to use together. Can I run a multiplex PCR with them?. How? Very likely, yes.Try amplify all loci

38、seaprately using the same PCR program. If one of the primer pairs yields unspecific products, keep the cycling conditions constant and change other parameters as mentioned above (#1 and #2).Mix equimolar amounts of primers and run the multiplex reaction either in the same cycling conditions or by de

39、creasing only the annealing temperature by 4 C.If some of the loci are weak or not amplified, read below ! 7. How many loci can I amplify in multiplex PCR at the same time? Difficult to say. The author has routinely amplified from 2 to 14 loci.Literature describes up to 25 loci or so. 8. One or a fe

40、w loci in my multiplex reaction are very weak or invisible. How can amplify them? The first choice should be increasing the amount of primer for the weak loci at the same time with decreasing the amount of primer for all loci that can be amplified. The balance between these amounts is more important

41、 than the absolute values used !.Check primer sequences for primer-primer interactions 9. Short PCR products in my multiplex reaction are weak. How can I improve their yield? Increase KCl (buffer) concentration to 1.2x-2x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mMDecrease denaturing timeDecrease annea

42、ling time and temperatureDecrease extension time and temperatureIncrease amount of primers for the weak loci while decreasing the amount for the strong loci.Add adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 g/L final concentration). You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSO or glycerolCombine some/

43、all of the above 10. Longer PCR products in my multiplex reaction are weak. How can I improve their yield? Decrease KCl (buffer) concentration to 0.7-0.8x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mMIncrease MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constant.Increase denaturing time

44、Increase annealing timeDecrease annealing temperatureIncrease extension time and temperatureIncrease amount of primers for the weak loci while decreasing the amount for the strong lociAdd adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 g/L final concentration). You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSO or glycerolCombine some/all of the above 11. All products in my multiplex reaction are weak. How can I improve the yield? Decrease annealing time in small steps (2 C)Decrease extension temperature to 62-68 CIncrease extension timeIncrease template concentrationIncrease overall primer