細(xì)胞生物學(xué)復(fù)習(xí)重點(diǎn)

1、第二章 細(xì)胞的統(tǒng)一性與多樣性n 本章要點(diǎn): 1、掌握原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的區(qū)別。 2、理解為什么支原體是最小的細(xì)胞。 3、了解病毒的生活史和進(jìn)化地位。第一節(jié) 細(xì)胞的基本概念一、細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位 1.一切有機(jī)體都由細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞是構(gòu)成有機(jī)體的基本單位2.細(xì)胞具有獨(dú)立的、有序的自控代謝體系，細(xì)胞是代謝與功能的基本單位3.細(xì)胞是有機(jī)體生長與發(fā)育的基礎(chǔ)4.細(xì)胞是遺傳的基本單位，細(xì)胞具有遺傳的全能性5.沒有細(xì)胞就沒有完整的生命 二、細(xì)胞概念的一些新思考細(xì)胞是多層次非線性的復(fù)雜結(jié)構(gòu)體系 細(xì)胞具有高度復(fù)雜性和組織性細(xì)胞是物質(zhì)（結(jié)構(gòu)）、能量與信息過程精巧結(jié)合的綜合體 細(xì)胞完成各種化學(xué)反應(yīng)； 細(xì)胞需要和利

2、用能量； 細(xì)胞參與大量機(jī)械活動(dòng)； 細(xì)胞對刺激作出反應(yīng)；細(xì)胞是高度有序的，具有自組裝能力與自組織體系。 細(xì)胞能進(jìn)行自我調(diào)控； 繁殖和傳留后代；三、細(xì)胞的基本共性1. 所有的細(xì)胞都有相似的化學(xué)組成。2. 所有的細(xì)胞表面均有由磷脂雙分子層與鑲嵌蛋白質(zhì)構(gòu)成的生物膜，即細(xì)胞膜。3. 所有的細(xì)胞都含有兩種核酸：即DNA與RNA作為遺傳信息復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的載體。4. 作為蛋白質(zhì)合成的機(jī)器核糖體，毫無例外地存在于一切細(xì)胞內(nèi)。5. 所有細(xì)胞的增殖都以一分為二的方式進(jìn)行分裂。第二節(jié) 原核細(xì)胞與真核細(xì)胞一、 原 核 細(xì) 胞基本特點(diǎn)：1、遺傳的信息量小，一個(gè)環(huán)狀DNA構(gòu)成；2、細(xì)胞內(nèi)沒有分化為以膜為基礎(chǔ)的具有專門結(jié)構(gòu)與功

3、能的細(xì)胞器和細(xì)胞核膜。主要代表：1、支原體（mycoplast）最小最簡單的細(xì)胞；2、細(xì)菌3、藍(lán)藻又稱藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）1、支原體 支原體是目前發(fā)現(xiàn)的最簡單、最小的原核細(xì)胞，也是惟一一種沒有細(xì)胞壁的原核細(xì)胞。1、 大小：是原核細(xì)胞生物中最小的，一般0.10.3m；2、 結(jié)構(gòu)：最外層為細(xì)胞膜，三層結(jié)構(gòu)，內(nèi)外層為蛋白質(zhì)，中間層為脂質(zhì)；少數(shù)有莢膜，有的有特殊的頂端結(jié)構(gòu)；3、 增殖方式：以二分裂繁殖為主；4、 基因組：為一分子量小的環(huán)狀雙股DNA；5、 形態(tài)與染色：多形性，革蘭染色陰性但不易著染。為什么說支原體是最小的細(xì)胞？1. 質(zhì)膜、DNA、RNA、核糖體和某些必須的酶是一個(gè)細(xì)胞生

4、存與繁殖必須具備的物質(zhì)基礎(chǔ)。支原體均已具備。2. 從保證一個(gè)細(xì)胞生命活動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)所必須的條件來看，至少需要100種酶（占據(jù)空間約直徑50nm）、數(shù)目不等的核糖體（1020nm/個(gè)）和核酸、質(zhì)膜。這樣，一個(gè)細(xì)胞的極限直徑不能小于100nm。3. 目前發(fā)現(xiàn)的最小支原體直徑已經(jīng)接近這個(gè)極限。2、細(xì)菌（1）是在自然界分布最廣、個(gè)體數(shù)量最多的有機(jī)體。（2）可分為：球菌、桿菌和螺旋菌（弧形菌）。（3）絕大多數(shù)細(xì)菌的直徑在0.55m之間。 細(xì)菌的界膜， 由一層堅(jiān)硬的細(xì)胞壁包裹起來，壁厚約15100 nm ，有些細(xì)菌的表面還有一層莢膜。莢膜：細(xì)菌最外表的一層多糖類物質(zhì)，邊界明顯的稱莢膜（capsule），如肺炎球

5、菌，邊界不明顯的稱粘液層（slime layer），如葡萄球菌。功能：抵御不良環(huán)境；保護(hù)自身不受吞噬；選擇性的粘附到特定細(xì)胞的表面上。 原核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜是多功能的， 其最重要的功能就是運(yùn)輸作用， 包括營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、廢物的排除、能量代謝等。細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)膜往往會(huì)內(nèi)陷折皺形成中膜體(mesosome)， 具有類似線粒體的作用， 故稱為擬線粒體。細(xì)菌質(zhì)膜還參與遺傳物質(zhì)的復(fù)制和分配，因?yàn)榧?xì)菌沒有細(xì)胞核，所以細(xì)菌的DNA在復(fù)制時(shí)只能結(jié)合在質(zhì)膜上，然后進(jìn)行細(xì)胞的分裂。 細(xì)菌的核結(jié)構(gòu)： 僅為DNA與少量RNA或蛋白質(zhì)結(jié)合物， 也沒有核仁和有絲分裂器。E.coli的DNA是環(huán)狀的，長為4.2106kb，約4

6、000個(gè)基因。細(xì)菌除了具有染色體DNA外，還有核外DNA，即質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒是比染色體小的遺傳物質(zhì)，為環(huán)狀的雙鏈DNA， 常常賦予細(xì)胞對抗生素的抗性。細(xì)菌體表還有菌毛和鞭毛。菌毛有兩種，一種短而細(xì)，具有呼吸作用；另一種是數(shù)量少但細(xì)長的性纖毛，為雄性菌所特有。鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官， 鞭毛蛋白的氨基酸組成與橫紋肌中的肌動(dòng)蛋白相似。 菌毛：細(xì)菌運(yùn)動(dòng)無關(guān)，分為普通菌毛和 鞭毛：是某些細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官，由一性菌毛兩類。前者與細(xì)菌吸附和侵染宿 種稱為鞭毛蛋白的彈性蛋白構(gòu)成，結(jié)主有關(guān)，后者為中空管子，與傳遞遺傳 構(gòu)上不同于真核生物的鞭毛。物質(zhì)有關(guān)。3、藍(lán)藻細(xì)胞1. 又稱藍(lán)細(xì)菌，是最簡單的自養(yǎng)生物。它的光合作用

7、類似于高等植物 ，而不同于光合細(xì)菌。沒有葉綠體，但有質(zhì)膜內(nèi)陷形成的捕光裝置。2. DNA分子環(huán)狀，但遺傳信息量很大，可與高等植物相比。3. 體積比其它原核細(xì)胞大得多，直徑約10m左右，甚至可達(dá)70m (顫藻)。4. 屬單細(xì)胞生物，但有些藍(lán)藻經(jīng)常以絲狀的細(xì)胞群體存在，如：屬藍(lán)藻門念珠藻類的發(fā)菜就是藍(lán)藻的絲狀體。二、古 細(xì) 菌（archaebacteria）l 分布l 進(jìn)化地位及主要證據(jù)進(jìn)化證據(jù)（1）細(xì)胞壁成分：（2）DNA與基因結(jié)構(gòu)：重復(fù)序列、內(nèi)含子。（3）有類核小體結(jié)構(gòu)：（4）有類似真核細(xì)胞的核糖體：（5）5S rRNA分子進(jìn)化分析： 除上述各點(diǎn)外，還有其他一些類似依據(jù)，說明古細(xì)菌與真核生物在

8、進(jìn)化上的關(guān)系較真細(xì)菌類更為密切。三、真 核 生 物l 真核細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)體系l 細(xì)胞的大小及其分析l 原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的比較1、 真核細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)體系 以脂質(zhì)及蛋白質(zhì)成分為基礎(chǔ)的生物膜結(jié)構(gòu)系統(tǒng)； 以核酸（DNA或RNA）與蛋白質(zhì)為主要成分的遺傳信息表達(dá)系統(tǒng)； 由特異蛋白分子裝配構(gòu)成的細(xì)胞骨架系統(tǒng)。2、 細(xì)胞的大小分析各類細(xì)胞直徑的比較細(xì)胞類型直徑大?。╱m）最小的病毒0.02支原體細(xì)胞0.10.3細(xì)菌細(xì)胞12動(dòng)植物細(xì)胞2030(1050)原生動(dòng)物細(xì)胞數(shù)百至數(shù)千細(xì)胞體積為什么不能無限大？1.隨著直徑的增加，細(xì)胞體積與表面的增長速度不一樣，從而限制體積的無限增大。2.更重要的是，胞內(nèi)重要分子濃

9、度的維持是細(xì)胞生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。體積太大會(huì)造成濃度的降低。真核細(xì)胞通過內(nèi)膜系統(tǒng)造成細(xì)胞隔室，維持特定分子的濃度。四、原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的比較原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基本特征的比較原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的遺傳結(jié)構(gòu)裝置和基因表達(dá)的比較五、植物細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞的比較u 細(xì)胞壁 u 液泡 u 葉綠體 第三節(jié) 病毒一、病毒的基本知識(shí)1.病毒（virus）核酸分子（DNA或RNA）與蛋白質(zhì)構(gòu)成的核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合體；根據(jù)病毒的核酸類型可以將其分為兩大類：n DNA病毒與RNA病毒n 病毒的多樣性2.類病毒（viroid）僅由感染性的RNA構(gòu)成；3.朊病毒（prion） 僅由感染性的蛋白質(zhì)亞基構(gòu)成；二、病毒的生活史u 侵入

10、、感染細(xì)胞u 核酸復(fù)制、表達(dá)u 病毒成熟、釋放二、 病毒與細(xì)胞在起源與進(jìn)化中的關(guān)系 病毒是非細(xì)胞形態(tài)的生命體，它的主要生命活動(dòng)必須要在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)。病毒與細(xì)胞在起源上的關(guān)系，目前存在3種主要觀點(diǎn)：生物大分子病毒細(xì)胞生物大分子：（1）病毒 （2）細(xì)胞生物大分子細(xì)胞 病毒思考題1、為什么說支原體是最小的細(xì)胞？2、原核細(xì)胞和真核的主要區(qū)別？3、你認(rèn)為病毒的進(jìn)化地位如何？為什么？第三章 細(xì)胞生物學(xué)的研究方法1、了解細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法；2、了解細(xì)胞組分的分析方法；3、了解細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程技術(shù)；4、分子生物學(xué)方法。第一節(jié) 顯微鏡技術(shù)一、顯微鏡與分辨率（1）、明視距離： 物體在人眼視網(wǎng)膜上成像的大小和物

11、體與眼睛的距離有關(guān)。物體離眼睛的距離越近，視網(wǎng)膜上的物像就大，但眼睛的曲光度就隨之增大，眼部肌肉就越發(fā)疲勞。經(jīng)測試在物體離人眼25cm時(shí)，看物體又清楚，眼肌也不疲勞，因此把人眼正常工作距離定為25cm，稱之為明視距離。（2）、分辨力和光鏡的分辨極限分辨力（Resolution）：又叫分辨本領(lǐng)，是指將鄰近兩點(diǎn)清晰區(qū)分辨認(rèn)的能力。分辨極限（Limit of resolution）對可見光來說，能清楚分辨出相鄰兩點(diǎn)之間的最小間隔為0.2mm。R 0.61 l / n .sin q 0.610.5 mm / 1.51 0.2 mm二、光學(xué)顯微鏡技術(shù)1、普通光學(xué)顯微鏡技術(shù)顯微鏡結(jié)構(gòu)： 機(jī)械部分：鏡座、鏡

12、柱、鏡臂 鏡筒、調(diào)焦裝置、 載物臺(tái)（物鏡轉(zhuǎn)換器） 照明部分：反光鏡、聚光鏡 光學(xué)部分：目鏡、物鏡放大倍數(shù)：目鏡的放大倍數(shù)物鏡的放大倍數(shù)2、熒光顯微鏡技術(shù)(fluorescence microscopy)是以紫外線為光源來激發(fā)生物標(biāo)本中的熒光物質(zhì)，產(chǎn)生能觀察到各種顏色熒光的一種光學(xué)顯微鏡。利用它可研究熒光物質(zhì)在組織和細(xì)胞內(nèi)的分布。熒光（Fluorescence）：細(xì)胞中的某些物質(zhì)（如葉綠素）經(jīng)紫外線照射后能發(fā)出可見光線，稱為熒光。自發(fā)熒光：由細(xì)胞本身存在的物質(zhì)經(jīng)紫外線照射后發(fā)出的熒光。誘發(fā)熒光：一些細(xì)胞成分本身經(jīng)紫外線照射后不發(fā)熒光，但用熒光染料（酸性品紅、甲基綠、吖叮橙等熒光色素）進(jìn)行活體染色

13、或固定后切片染色，就能在熒光鏡下看見熒光，這種熒光叫誘發(fā)熒光。 用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。3、相差顯微鏡技術(shù)只有光線通過染色標(biāo)本時(shí)其波長、振幅發(fā)生變化，人眼才能看見，但活細(xì)胞和未染色的標(biāo)本由于光波長和振幅不發(fā)生變化，人眼看不到，但其相位有變化，因此利用光的干涉和衍射效應(yīng)把透過標(biāo)本不同區(qū)域的光波光程差轉(zhuǎn)變成振幅差，使細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間呈現(xiàn)清晰可見的明暗對比。相差顯微鏡比普通光鏡多了2個(gè)部件：1）在聚光器上增加一個(gè)環(huán)形光闌；2）在物鏡后焦面增加一個(gè)相板，相板上有一個(gè)環(huán)形區(qū)，通過環(huán)形區(qū)的光比從其它區(qū)域透過的光超前或滯后14l，這樣就使通過標(biāo)本不同區(qū)域光波的相

14、位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹睢?光通過標(biāo)本致密區(qū)時(shí)發(fā)生衍射，產(chǎn)生偏折光，相位和未受影響的直射光相比被推遲了14l。只有未發(fā)生偏折的的直射光可通過相位板的環(huán)形區(qū)，其它的偏折光在物鏡的后焦面上產(chǎn)生了一個(gè)與通過相位板的環(huán)形區(qū)的光不同的1/4的光程差。兩組光在平面上成像。如相板的環(huán)形區(qū)使直射光超前1/4，加上開始直射光超前的1/4，直射光共超前1/2，直射光和偏折光疊加形成的合成波振幅減少，產(chǎn)生暗反差。 如相板的環(huán)形區(qū)使直射光滯后1/4，加上開始直射光超前的1/4，兩者相抵直射光不發(fā)生變化，直射光和偏折光無相位變化，形成的合成波振幅增加，產(chǎn)生明反差。結(jié)果未經(jīng)染色的活細(xì)胞內(nèi)的各種組織就可顯現(xiàn)不同的明暗對比。相差顯微

15、鏡可觀察活細(xì)胞的各種活動(dòng)，如細(xì)胞遷移、分裂，運(yùn)動(dòng)等。3、 共焦激光掃描顯微鏡技術(shù)共焦激光掃描顯微鏡技術(shù) 是在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上裝有激光掃描裝置，以單色激光作為光源，使樣品被激發(fā)出熒光，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像。共焦顯微鏡利用激光掃描束經(jīng)照明孔形成點(diǎn)光源對標(biāo)本內(nèi)焦平面上的每一點(diǎn)掃描，由于照明孔與檢測孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明孔和檢測孔，焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在檢測孔處成像，這樣就得到了標(biāo)本清晰的光學(xué)切面圖，克服了普通光鏡圖像模糊的缺點(diǎn)。在顯微鏡載物臺(tái)上加一個(gè)微量步進(jìn)馬達(dá)，使載物臺(tái)上下移動(dòng)，改變焦平面，不同層次的光切面圖像經(jīng)計(jì)算機(jī)

16、圖像三維重組，就能獲得樣品的立體結(jié)構(gòu)圖像。 l 用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。l 能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。l 分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。l 用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。三、 電子顯微鏡技術(shù)光鏡分辯極限為0.2mm，小于0.2mm的微細(xì)結(jié)構(gòu)的光波可產(chǎn)生衍射現(xiàn)象,這種光波經(jīng)過物體時(shí)可繞過物體就象無物體經(jīng)過一樣,因此無法用光鏡觀察。這就需要一種更大分辮力的儀器來觀察比0.2mm更小的物體的微細(xì)結(jié)構(gòu)。 電子波長比光波短得多,用電子波代替光波可提高顯微鏡的分辯力。電鏡就是根據(jù)這樣的原理產(chǎn)生的。r=0.61/NA一、 透射電鏡（TEM）1.原理n 以電子束作光源，電

17、磁場作透鏡。電子束的波長短，并且波長與加速電壓(通常50120KV)的平方根成反比。n 由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。n 分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍。n 用于觀察超微結(jié)構(gòu)（ultrastructure），即小于0.2m、光學(xué)顯微鏡下無法看清的結(jié)構(gòu)，又稱亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopic structures）。1）、透射電鏡標(biāo)本制備過程:取材:盡可能保持生活狀態(tài),避免損傷必須耐真空。固定:常用戊二醛和四氧化鋨固定戊二醛在蛋白質(zhì)分子之間形成共價(jià)鍵,將它們交聯(lián)在一起。脫水:電鏡不能觀察含水的生物標(biāo)本，需經(jīng)脫水處理。包埋:常用環(huán)氧樹脂。切

18、片:電子穿透力弱,需制成50100nm厚的薄片。染色:常用的染色劑：醋酸鈾、枸櫞酸鉛。2）、提高樣品反差的方法負(fù)染法:將病毒、纖維、核糖體或分離的生物大分子樣品放于覆有親水性支持膜的載網(wǎng)上,滴加磷鎢酸,樣品干燥后重金屬鹽沉積于樣品周圍使樣品和背景形成顯著的明暗對比,這種染背景而不染樣品的方法叫負(fù)染。冷凍蝕刻復(fù)型電鏡技術(shù)亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露出了斷面結(jié)構(gòu)。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica）。冷凍：制冷劑（一般為液態(tài)氮）快速冷凍，使樣品固定。斷裂：在低溫真空中將樣品劈開，斷裂面上可見各種細(xì)

19、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。蝕刻：升溫使冰升華，細(xì)胞內(nèi)外含水多的地方因失水而下陷，膜和其它結(jié)構(gòu)顯露出來，增強(qiáng)了斷面的浮雕效果。復(fù)型：以45噴鉑金，90噴碳固定，顯示立體結(jié)構(gòu)。剝膜：將樣品取出，浸泡于腐蝕夜中將生物組織腐蝕掉，只剩下鉑碳復(fù)型膜，撈于載網(wǎng)上干燥后透射電鏡觀察。二、掃描電子顯微鏡20世紀(jì)60年代問世，用來觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。分辨力為610nm，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個(gè)光點(diǎn)的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。工作原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由探測器收集，信號(hào)經(jīng)放大用來

20、調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。掃描電子顯微鏡原理三、掃描隧道顯微鏡原理：根據(jù)隧道效應(yīng)而設(shè)計(jì)，當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個(gè)納米的高度上掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。分辨率：橫向?yàn)?.10.2nm，縱向可達(dá)0.001nm。用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。第二節(jié) 細(xì)胞組分的分離方法一、 細(xì)胞組分的

21、分級(jí)分離原理：1）利用顆粒大小的不同: 差速離心法 速度區(qū)帶離心法 2）利用顆粒密度的不同: 等密度離心法1、差速離心法：用于分離大小、形狀不同顯著的組分，根據(jù)顆粒沉降速度不同得以分離2、速度區(qū)帶離心法：用于分離密度相近而大小不一的組分3、等密度離心法：按細(xì)胞組分的浮力密度不同進(jìn)行分離的方法。適用于大小、形態(tài)相似而密度不同的組分。常將樣品通過高濃度的蔗糖或氯化銫的密度梯度沉降在達(dá)到與自身密度相等的位置就停滯不再向下沉降。此方法直接證明了DNA的不保留復(fù)制。二、 細(xì)胞化學(xué)技術(shù)主要是指利用某些顯色劑與待檢物質(zhì)（蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂質(zhì)等大分子）中的某些特定基團(tuán)特異性結(jié)合特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定

22、位及顏色深淺來判斷待檢物質(zhì)在細(xì)胞中的分布與含量。（一） 胞內(nèi)特定蛋白質(zhì)的顯示與定位例如：酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)通過酶的特異生化反應(yīng)來顯示酶在細(xì)胞內(nèi)的分布及酶活性強(qiáng)弱。水解酶細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)如：磷酸水解酶的定位（Pb2+）氧化還原酶細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)如：過氧化氫酶定位（DAB餓酸）又如：特異蛋白抗原免疫定位技術(shù)常用的標(biāo)記方法：1)熒光標(biāo)記：異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明2)酶標(biāo)記：辣根過氧化物酶（HRP）3)鐵蛋白標(biāo)記：鐵蛋白是含鐵離子的蛋白質(zhì)，在電鏡下鐵離子可顯黑色4)膠體金標(biāo)記：即金的水溶液，具有一般溶液的特性，用它與抗體標(biāo)記后，經(jīng)抗原抗體反應(yīng)可定位抗原的存在。（二）特異核酸序列的定位與定性核酸分子雜交：

23、按照堿基互補(bǔ)配對原則，將不同來源的序列互補(bǔ)單鏈的DNA/DNA，RNA/RNA，RNA/DNA，互補(bǔ)配對成雙鏈雜交分子，這一過程叫核酸分子雜交。 原位雜交：用核苷酸探針對特殊的核苷酸順序在其原位進(jìn)行雜交,叫原位雜交。可用于DNA、RNA定位研究。二、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction，PCR）又叫體外基因擴(kuò)增技術(shù)。利用人工合成的一對引物，在被擴(kuò)增DNA模板鏈的兩端形成雙鏈，由DNA聚合酶催化一對引物之間的聚合反應(yīng)。 具體過程： 變性：將雙鏈DNA加熱（95）使之變性，DNA雙鏈 變成單鏈 退火：降低溫度至56使引物與模板DNA單鏈結(jié)合 延伸：將溫度升至72，在

24、DNA聚合酶作用下，在引物3端進(jìn)行延伸，使原模板DNA的一條鏈變成兩條鏈。（三）、放射自顯影術(shù)(autoradiography)放射性核素在蛻變過程中發(fā)出帶電粒子可使感光材料感光。利用這樣的特性，用放射性化合物脈沖標(biāo)記活細(xì)胞,經(jīng)固定、切片后在暗處把感光乳膠覆蓋于切片上,在此期間,由于放射性同位素衰變使乳膠曝光,經(jīng)顯影、定影,根據(jù)銀粒所在部位,就可知道細(xì)胞中放射性物質(zhì)的分布。一般用14C和3H標(biāo)記。常用3H-TDR來顯示DNA，用3H-UDR顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)；用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。（四）、流式細(xì)胞儀技術(shù)用途：對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。原理：包在鞘液

25、中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計(jì)。第三節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程技術(shù)一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)二、植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)三、細(xì)胞工程技術(shù)第四節(jié) 細(xì)胞生物學(xué)常用模式生物一、病毒：遺傳學(xué)操作、生命物質(zhì)自組裝二、細(xì)菌：基因工程操作、基因表達(dá)調(diào)控研究三、酵母：細(xì)胞周期研究四、線蟲：細(xì)胞凋亡研究五、果蠅：遺傳學(xué)研究模式生物六、斑馬魚：胚胎發(fā)育研究七、小鼠：胚胎學(xué)、組織學(xué)、胚胎學(xué)第四章 細(xì)胞質(zhì)

26、膜知識(shí)要點(diǎn)： 1 、掌握幾種膜分子結(jié)構(gòu)模型學(xué)說，并評價(jià)之。 2 、了解膜結(jié)構(gòu)的組成成分和組成方式。 3 、理解質(zhì)膜流動(dòng)性和不對稱性兩大特點(diǎn)。 4、了解紅細(xì)胞膜骨架的組成和功能。第一節(jié) 細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)模型與成分一、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)膜(membrane)是細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)， 包括細(xì)胞質(zhì)膜 (plasma membrane)、內(nèi)膜 (internal membrane)， 習(xí)慣上把細(xì)胞所有膜結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱為生物膜(biomembrane)。雖然細(xì)胞很早就在光鏡下被發(fā)現(xiàn),但其是否有明確的邊界結(jié)構(gòu),尚未可知,直到電鏡發(fā)明發(fā)現(xiàn)質(zhì)膜的超微結(jié)構(gòu),但人們并不驚奇,因?yàn)樵诖酥耙褌芍?、關(guān)于膜的化學(xué)組成的早期研究:18世紀(jì)90年

27、代，Overton 用植物的根毛作實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)脂溶性物質(zhì)很容易進(jìn)入細(xì)胞，而水溶性的物質(zhì)卻不能。實(shí)際上他發(fā)現(xiàn)了親脂性(lipophilic)物質(zhì)與細(xì)胞的關(guān)系。根據(jù)這一研究結(jié)果，Overton認(rèn)為在細(xì)胞的外被中有脂的存在， 他還進(jìn)一步推測，細(xì)胞的外被中很可能有膽固醇和卵磷脂的存在， 這種推測后來被證明是完全正確的。2、脂單層(lipid monolayer)的發(fā)現(xiàn)：Irving Langmuir將紅細(xì)胞的膜脂提取后鋪展在水盤的水面上，研究了脂的展層行為，提出脂單層的設(shè)想3、脂雙層(lipid bilayer)的發(fā)現(xiàn)：1925年，荷蘭科學(xué)家E.Gorter和F.Grendel用丙酮抽提人紅細(xì)胞膜按La

28、ngmuir的方法鋪展在水相上，發(fā)現(xiàn)展層后脂單層的面積和根據(jù)體積所推算的總面積（顯微鏡下紅細(xì)胞為直徑約為7m的扁平狀, 據(jù)此推測紅細(xì)胞的表面積約為100m2）之比為1.82.21 ，為了解釋這一結(jié)果，他們提出紅細(xì)胞膜的基本結(jié)構(gòu)是脂雙層。4、片層結(jié)構(gòu)模型1935年James Daniellie和Hugh Davson發(fā)現(xiàn)質(zhì)膜的表面張力比單純油水界面的要低得多,而當(dāng)時(shí)就已知若脂滴吸附有蛋白質(zhì)會(huì)降低其表面張力, 從而提出“雙分子片層”結(jié)構(gòu)模型。該模型是第一次用分子術(shù)語描述的結(jié)構(gòu)，并將膜結(jié)構(gòu)同所觀察到的生物學(xué)理化性質(zhì)聯(lián)系起來，對后來的研究有很大的啟發(fā)。5、單位膜模型(unit membrane mod

29、el)1959年，J.D.Robertson在電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜是類似鐵軌結(jié)構(gòu)，兩條暗線被一條明亮的帶隔開，顯示暗明暗三層，總厚度為7.5nm，中間層為3.5nm，內(nèi)外兩層各為2nm。并推測:暗層是蛋白質(zhì)，透明層是脂，并建議將這種結(jié)構(gòu)稱為單位膜。單位膜模型的評價(jià)單位膜模型與片層結(jié)構(gòu)模型相似，但它認(rèn)為膜脂兩側(cè)蛋白質(zhì)為折疊片狀, 另外, 還認(rèn)為膜外側(cè)表面蛋白是糖蛋白,且膜蛋白在兩側(cè)的分布是不對稱的。這一模型能夠解釋細(xì)胞質(zhì)膜的一些基本特性，例如質(zhì)膜有很高的電阻，這是由于膜脂的非極性端的碳?xì)浠衔锸遣涣紝?dǎo)體的緣故；再如由于膜脂的存在，使它對脂溶性強(qiáng)的非極性分子有較高的通透性，而脂溶性弱的小分子則不

30、易透過膜。單位膜也有一些不足首先該模型把膜看成是靜止的,無法說明膜如何適應(yīng)細(xì)胞生命活動(dòng)的變化；其二，不同的膜其厚度不都是7.5 nm,一般在510 nm之間；其三，若蛋白質(zhì)是伸展的, 則不能解釋酶的活性同構(gòu)型的關(guān)系。最后，該模型也不能解釋為什么有的膜蛋白很容易被分離，有些則很難。6、流動(dòng)鑲嵌模型1972年Singer和Nicolson總結(jié)了當(dāng)時(shí)有關(guān)膜結(jié)構(gòu)模型及各種研究的新成就，提出了流動(dòng)鑲嵌模型。 這一模型強(qiáng)調(diào)了膜的流動(dòng)性和不對稱性，認(rèn)為球形膜蛋白分子以各種鑲嵌形式與脂雙分子層相結(jié)合,且這些蛋白大多是功能蛋白。流動(dòng)鑲嵌模型的主要內(nèi)容細(xì)胞膜由流動(dòng)的雙脂層和嵌在其中的蛋白質(zhì)組成。磷脂分子以疏水性尾

31、部相對，極性頭部朝向水相組成膜骨架；蛋白質(zhì)或嵌在雙脂層表面，或嵌在其內(nèi)部，或橫跨整個(gè)雙脂層，表現(xiàn)出分布的不對稱性。流動(dòng)鑲嵌模型評價(jià)流動(dòng)相嵌模型有兩個(gè)主要特點(diǎn)。其一,蛋白質(zhì)不是伸展的片層,而是以折疊的球形鑲嵌在脂雙層中,蛋白質(zhì)與膜脂的結(jié)合程度取決于膜蛋白中氨基酸的性質(zhì)。其二膜有一定的流動(dòng)性,不再是封閉的片狀結(jié)構(gòu),以適應(yīng)細(xì)胞各種功能的需要。這一模型強(qiáng)調(diào)了膜的流動(dòng)性和不對稱性,較好地體現(xiàn)細(xì)胞的功能特點(diǎn),被廣泛接受,也得到許多實(shí)驗(yàn)的支持。7、脂筏（lipid raft）模型脂筏：是富含膽固醇和鞘磷脂的微結(jié)構(gòu)域，大小70nm左右，是一種動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)介于無序液體與液晶之間，稱為有序液體，位于質(zhì)膜的外小

32、頁。該模型認(rèn)為細(xì)胞膜主要由不同類型的脂筏組成，脂筏上的蛋白質(zhì)少數(shù)用以維持“筏”結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，多數(shù)功能蛋白則借助“筏”的漂流，使脂筏就像一個(gè)蛋白質(zhì)停泊的平臺(tái)，與膜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)分選均有密切的關(guān)系。二、細(xì)胞膜的成分脂和蛋白質(zhì)是膜的主要成分， 同時(shí)還有少量的糖類。構(gòu)成膜的蛋白質(zhì)與脂的比例依據(jù)膜的類型(如質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、高爾基體膜)、細(xì)胞類型(肌細(xì)胞、肝細(xì)胞)、生物類型(動(dòng)物、植物和原核生物)的不同而不同。一般而言，膜脂占50%，蛋白質(zhì)占40%，碳水化合物約1-10%1、 膜脂膜脂都具有雙親性，這種性質(zhì)使生物膜具有屏障作用，大多數(shù)水溶性物質(zhì)不能自由通過，只允許親脂性物質(zhì)通過。膜脂是生物膜的基本組成成

33、分， 主要有三大類型:磷脂、糖脂、膽固醇。 （1）磷脂(phospholipids) 含有磷酸基團(tuán)的脂稱為磷脂，是細(xì)胞膜中含量最豐富和最具特性的脂。它有一個(gè)極性的頭部和一個(gè)疏水的尾部。磷脂分子的主要特點(diǎn):一個(gè)極性頭部,兩個(gè)非極性尾部。脂肪酸鏈為偶數(shù),一般如16、18、20 尾部常含有不飽和脂肪酸，造成尾部小角度的彎曲。磷脂與脂質(zhì)體膜脂都是兩性物質(zhì)， 都具有親水的極性頭和疏水的非極性的尾， 大多數(shù)磷脂和糖脂在水溶液中能夠自動(dòng)形成雙分子層結(jié)構(gòu)。當(dāng)這些兼性分子被水環(huán)境包圍時(shí)， 它們就聚集起來， 將疏水的尾部埋在里面， 親水的頭部露在外面與水接觸?？赡苡袃煞N形式: 形成球狀的分子團(tuán)(micelles)

34、， 把尾部包在里面；或者形成雙分子層(bilayers)， 把疏水的尾部夾在頭部的中間， 或形成脂質(zhì)體( liposome)。（2 ）糖脂膜中的碳水化合物約占膜重量的110%，糖含量的多少依細(xì)胞的不同而不同。細(xì)胞質(zhì)膜上所有的膜糖都位于質(zhì)膜的外表面，內(nèi)膜系統(tǒng)中的膜糖則位于內(nèi)表面。 膜糖的種類自然界存在的單糖及其衍生物有200多種， 但存在于膜的糖類只有其中的9種， 而在動(dòng)物細(xì)胞膜上的主要是7種。糖脂的功能l 細(xì)胞的信號(hào)識(shí)別、細(xì)胞粘著。如膜蛋白中的糖基是細(xì)菌和病毒感染時(shí)的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)。l 人的血型是A型、B型、AB型還是O型，是由紅細(xì)胞膜脂或膜蛋白中的糖基決定的。l A血型的人紅細(xì)胞膜脂寡糖鏈的

35、末端是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，B血型的人紅細(xì)胞膜脂寡糖鏈的末端是半乳糖(Gal)，O型則沒有這兩種糖基，而AB型的人則在末端同時(shí)具有這兩種糖。糖脂與血型ABO血型是由ABO血型抗原決定的， 它是一種糖脂， 其寡糖部分具有決定抗原特異性的作用。（3）膽固醇細(xì)胞膜上另一類脂是固醇類的膽固醇， 膽固醇存在于真核細(xì)胞膜中。動(dòng)物細(xì)胞膜膽固醇的含量較高，有的占膜脂的50%，大多數(shù)植物細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜中沒有膽固醇，酵母細(xì)胞膜中是麥角固醇。膽固醇的分子較其他膜脂要小， 雙親媒性也較低。膽固醇的親水頭部朝向膜的外側(cè)，疏水的尾部埋在脂雙層的中央。功能：膽固醇分子是扁平和環(huán)狀的,對磷脂的脂肪酸尾部的運(yùn)動(dòng)

36、具有干擾作用，所以膽固醇對調(diào)節(jié)膜的流動(dòng)性、加強(qiáng)膜的穩(wěn)定性有重要作用。（4）膜脂的運(yùn)動(dòng)方式膜脂的幾種主要流動(dòng)方式2、 膜蛋白由膜脂構(gòu)成膜的基本結(jié)構(gòu)， 但是生物膜的特定功能主要是由蛋白質(zhì)決定的。功能越復(fù)雜的膜，其上的蛋白質(zhì)種類越多。分類（1）、整合蛋白(integral protein)含疏水氨基酸成分較高，親水部分暴露在膜的一側(cè)或兩側(cè)表面，疏水區(qū)同脂雙分子層尾部相互作用?？煞譃閱未慰缒?、多次跨膜、多亞基跨膜等。跨膜蛋白一般含25%50%的螺旋, 也有折疊，如孔蛋白。整合蛋白與膜的結(jié)合方式1、跨膜結(jié)構(gòu)域與脂雙層疏水核心的相互作用?？缒^(qū)螺旋（20aa）外部疏水側(cè)鏈與脂雙層脂肪酸側(cè)鏈通過范德華力作用

37、相互作用，這是絕大多數(shù)跨膜蛋白的共同特征。有的跨膜蛋白螺旋外側(cè)是非極性鏈，而螺旋內(nèi)側(cè)為極性鏈，形成水溶性通道。有的跨膜蛋白（約10aa）通過反向平行的折疊相互作用形成非特異性的跨膜通道。2、通過蛋白質(zhì)aa側(cè)鏈電荷與膜脂帶負(fù)電的極性頭部相結(jié)合。3、通過胞質(zhì)側(cè)Cys上的脂肪酸分子，插入到膜雙層中。（2）、外周蛋白這種蛋白完全外露在脂雙層的內(nèi)外兩側(cè)，主要是通過非共價(jià)鍵附著在脂的極性頭部， 或整合蛋白親水區(qū)的一側(cè)， 間接與膜結(jié)合。外周蛋白可以增加膜的強(qiáng)度,或是作為酶起某種特定的反應(yīng),或是參與信號(hào)分子的識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。（3）、脂錨定蛋白脂錨定蛋白(lipid-anchored) ，通過共價(jià)鍵與脂分子結(jié)合

38、。一是蛋白質(zhì)直接結(jié)合于脂雙分子層。二是通過一個(gè)糖分子間接同脂結(jié)合。前者如 Src 和Ras通過長的包埋在脂雙層中的碳?xì)滏溸M(jìn)行錨定。與細(xì)胞從正常狀態(tài)向惡性狀態(tài)轉(zhuǎn)化有關(guān)。后者如糖基磷脂酰肌醇(GPI)主要是通過短的寡糖錨定在質(zhì)膜的外側(cè)，是膜受體、酶和細(xì)胞粘著分子。一種很少見的貧血-陣發(fā)性血紅蛋白夜尿就是GPI合成缺陷，導(dǎo)致紅細(xì)胞容易破裂所至。（4）、膜蛋白與去垢劑整合蛋白與膜的結(jié)合非常緊密，只有用去垢劑才能從膜上洗滌下來，如離子型去垢劑SDS，非離子型去垢劑Triton-X100。外周蛋白靠離子鍵或其它較弱的鍵與膜表面的蛋白質(zhì)分子或脂分子的親水部分結(jié)合，因此只要改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度甚至提高溫度就可以

39、從膜上分離下來，有時(shí)很難區(qū)分整合蛋白和外周蛋白，主要是因?yàn)橐粋€(gè)蛋白質(zhì)可以由多個(gè)亞基構(gòu)成，有的亞基為跨膜蛋白，有的則結(jié)合在膜的外部。第二節(jié) 細(xì)胞膜的特征與功能一、膜的流動(dòng)性(membrane fluidity)膜的流動(dòng)性是指構(gòu)成膜的脂和蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)性。膜的流動(dòng)性不僅是膜的基本特性之一， 也是細(xì)胞進(jìn)行生命活動(dòng)的必要條件。1、膜脂的流動(dòng)性（1）、膜脂的運(yùn)動(dòng)方式：（2）、影響膜脂流動(dòng)性的因素： 溫度：是影響膜流動(dòng)性的最主要的因素。 膜脂的組成（脂肪酸鏈的長度、脂肪酸鏈的飽和程度）。 膽固醇的影響：加強(qiáng)膜脂雙層的穩(wěn)定性， 增加膜脂有序性并降低其流動(dòng)性， 調(diào)節(jié)膜的機(jī)械性能。蛋白質(zhì)分子的影響：膽固醇脂對

40、膜流動(dòng)性的影響2、膜蛋白的流動(dòng)性（1）、膜蛋白的運(yùn)動(dòng)方式：u 隨機(jī)移動(dòng)：u 定向移動(dòng)：u 局部擴(kuò)散：3、 膜的流動(dòng)性的生理意義1.細(xì)胞質(zhì)膜適宜的流動(dòng)性是生物膜正常功能的必要條件。2.酶活性與流動(dòng)性有極大的關(guān)系，流動(dòng)性大活性高。3.如果沒有膜的流動(dòng)性，細(xì)胞外的營養(yǎng)物質(zhì)無法進(jìn)入，細(xì)胞內(nèi)合成的胞外物質(zhì)及細(xì)胞廢物也不能運(yùn)到細(xì)胞外，這樣細(xì)胞就要停止新陳代謝而死亡。4.膜流動(dòng)性與信息傳遞有著極大的關(guān)系。5.膜的流動(dòng)性與發(fā)育和衰老過程都有相當(dāng)大的關(guān)系。二、 膜的不對稱性(membrane asymmetry)細(xì)胞質(zhì)膜的不對稱性是指細(xì)胞質(zhì)膜脂雙層中各種成分不是均勻分布的，包括種類和數(shù)量的不均勻。1、 膜脂的不

41、對稱性 ：膜脂的不對稱性表現(xiàn)在脂雙層中分布的各類脂的比例不同， 各種細(xì)胞的膜脂不對稱性差異很大（圖3-29）。2、膜蛋白的不對稱性：主要指每種膜蛋白在膜中都有特定的排布方向，與其功能相適應(yīng)。膜蛋白的不對稱性包括外周蛋白分布的不對稱和整合蛋白內(nèi)外兩側(cè)氨基酸殘基數(shù)目的不對稱。3、膜糖的不對稱性：膜糖以糖蛋白或糖脂的形式存在，無論是糖蛋白還是糖脂的糖基都是位于膜的非胞質(zhì)面。4、膜不對稱性的意義膜成分分布的不對稱性導(dǎo)致了膜功能的不對稱性和方向性，保證了生命活動(dòng)的高度有序性。如： 糖脂位于脂雙層的外側(cè)，可作為細(xì)胞外配體的受體。 磷脂酰膽堿出現(xiàn)在衰老的淋巴細(xì)胞外表面，作為讓吞噬細(xì)胞吞噬的信號(hào)。磷脂酰ser

42、也出現(xiàn)在血小板的外表面，可作為血凝固的信號(hào)。 磷脂酰肌醇主要集中在內(nèi)葉，它們在將細(xì)胞質(zhì)膜的刺激向細(xì)胞質(zhì)傳遞中起關(guān)鍵作用。 細(xì)胞間的識(shí)別、運(yùn)動(dòng)、物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)傳遞等都具有方向性。這些方向性的維持就是靠分布不對稱的膜蛋白、膜脂和膜糖來提供。第三節(jié) 紅細(xì)胞膜骨架紅細(xì)胞的壽命約為120天，在生存期中大約行程500，000米。在血液循環(huán)中，紅細(xì)胞要穿過小于自身直徑一半的微小通道(脾竇)、在脾臟內(nèi)要經(jīng)受氧少、低pH值等不利環(huán)境的考驗(yàn)、在心臟內(nèi)又要受到瓣膜渦流沖擊。不難想像，紅細(xì)胞在這樣長而艱險(xiǎn)的運(yùn)輸途徑中保持結(jié)構(gòu)的完好，它的質(zhì)膜起了重要作用，可以推測，紅細(xì)胞的質(zhì)膜一定有非常特別的結(jié)構(gòu)，僅僅是雙脂層可能難以

43、解釋。紅細(xì)胞膜骨架（membrane associated cytoskeleten）：紅細(xì)胞質(zhì)膜的內(nèi)側(cè)有一種特殊的結(jié)構(gòu)，是由膜蛋白和纖維蛋白組成的網(wǎng)架，它參與維持細(xì)胞質(zhì)膜的形狀并協(xié)助質(zhì)膜完成多種生理功能。紅細(xì)胞膜蛋白的組成分離紅細(xì)胞膜后可用陰離子去垢劑溶解膜蛋白，并通過SDS和聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離膜蛋白。通過單向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)大約有15種主要的蛋白帶， 相對分子質(zhì)量為15kDa到250kDa。幾種主要的紅細(xì)胞膜蛋白是(其中血影蛋白、血型糖蛋白、帶3蛋白約占膜蛋白的60% 以上)： 血影蛋白(spectrin) 血型糖蛋白A(glycophorin A) 帶

44、3蛋白(band 3 protein) 肌動(dòng)蛋白(actin) 錨定蛋白(ankyrin) 帶4.1蛋白(band 4.1 protein)第五章 物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸本章重點(diǎn)：1、理解兩種類型膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的原理與特點(diǎn)。2、理解和掌握以鈉鉀泵的工作原理。3、理解協(xié)同運(yùn)輸是一種間接耗能的主動(dòng)運(yùn)輸過程的原理。4、掌握受體介導(dǎo)的胞吞作用的運(yùn)輸過程和原理。5、了解兩種形式胞吐作用的過程。第一節(jié) 膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與物質(zhì)跨膜運(yùn)輸一、脂雙層的不透性和膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白膜的不透性：細(xì)胞膜能進(jìn)行某些脂溶性分子和不帶電小分子的簡單運(yùn)輸，而對絕大多數(shù)溶質(zhì)分子和離子是高度不通透的。膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：某些陰、陽離子在細(xì)胞內(nèi)外的分布有差異，

45、而膜又是脂溶性屏障，故這種差異的形成還需要由一套膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來運(yùn)轉(zhuǎn)，尤其是很多有機(jī)小分子和帶電荷的無機(jī)離子。膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋：一類稱載體蛋白（carrier Proteins），如轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖分子的膜蛋白；另一類稱通道蛋白（channel Proteins），它可形成親水的通道，允許一定大小和一定電荷的離子通過。1、載體蛋白載體蛋白的類型：P103：表5-2。載體蛋白的運(yùn)輸特點(diǎn)是： 與特定的溶質(zhì)分子結(jié)合，通過一系列構(gòu)象改變介導(dǎo)溶質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)； 對所轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì)具有高度選擇性； 載體蛋白又稱為通透酶: 對物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程具有被類似物競爭性抑制、具有競爭性抑制等酶的特性。但它不對轉(zhuǎn)運(yùn)分子作任何共價(jià)修飾。2、通道蛋

46、白通道蛋白(channel protein)是一類橫跨質(zhì)膜，它們都是通過疏水的氨基酸鏈進(jìn)行重排，形成水性通道，允許適宜的分子通過。通道蛋白只參與被動(dòng)運(yùn)輸，轉(zhuǎn)運(yùn)速度高，無飽和性。其運(yùn)輸特點(diǎn)是：1) 離子選擇性：不同離子有不同的通道蛋白。2) 門控性：電壓門通道、配體門通道、應(yīng)力激活通道等。（1）、電壓門通道：特點(diǎn)：細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外特異離子濃度或電位發(fā)生變化時(shí)，致使其構(gòu)象變化，“門”打開。（2）、配體門通道：特點(diǎn)：受體與細(xì)胞外的配體結(jié)合，引起門通道蛋白發(fā)生構(gòu)象變化， “門”打開。又稱離子通道型受體?？煞譃殛栯x子通道，如乙酰膽堿（Ach）、谷氨酸和五羥色胺受體，和陰離子通道，如甘氨酸和氨基丁酸受體。A

47、ch受體是由4種不同的亞單位組成的5聚體蛋白質(zhì)，形成一個(gè)結(jié)構(gòu)為2的梅花狀通道樣結(jié)構(gòu)，其中的兩個(gè)亞單位是同兩分子Ach相結(jié)合的部位。（3）、應(yīng)力激活通道（4）、水通道水?dāng)U散通過人工膜的速率很低，人們推測膜上有水通道。1991年Agre發(fā)現(xiàn)第一個(gè)水通道蛋白CHIP28 （28 KD ），他將CHIP28的mRNA注入非洲爪蟾的卵母細(xì)胞中，在低滲溶液中，卵母細(xì)胞迅速膨脹，5 分鐘內(nèi)破裂。細(xì)胞的這種吸水膨脹現(xiàn)象會(huì)被Hg2+抑制。2003年Agre與離子通道的研究者M(jìn)acKinnon同獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。目前在人類細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)的此類蛋白至少有11種，被命名為水通道蛋白（Aquaporin，AQP）。二、被動(dòng)

48、運(yùn)輸與主動(dòng)運(yùn)輸（一）、簡單擴(kuò)散也叫自由擴(kuò)散（free diffusion）特點(diǎn)：沿濃度梯度（或電化學(xué)梯度）擴(kuò)散；不需要提供能量；沒有膜蛋白的協(xié)助。人工膜對各類物質(zhì)的通透率：脂溶性越高通透性越大，水溶性越高通透性越??；非極性分子比極性容易透過，極性不帶電荷小分子，如H2O、O2等可以透過人工脂雙層，但速度較慢；小分子比大分子容易透過；分子量略大一點(diǎn)的葡萄糖、蔗糖則很難透過；人工膜對帶電荷的物質(zhì)，如各類離子是高度不通透的。（二）、協(xié)助擴(kuò)散也稱促進(jìn)擴(kuò)散特點(diǎn)： 比自由擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)速率高； 運(yùn)輸速率同物質(zhì)濃度成非線性關(guān)系； 特異性；飽和性。 載體：離子載體和通道蛋白兩種類型。（三）、主動(dòng)運(yùn)輸主動(dòng)運(yùn)輸?shù)奶攸c(diǎn)是

49、：逆濃度梯度（逆化學(xué)梯度）運(yùn)輸；需要能量；都有載體蛋白。主動(dòng)運(yùn)輸所需的能量來源主要有：由 ATP直接或間接供能；光驅(qū)動(dòng)的泵利用光能運(yùn)輸物質(zhì)，見于細(xì)菌。第二節(jié) 離子泵和協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)離子泵：一種APTase，可以通過水解APT供能，逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)離子或某些小分子?？煞譃橐韵滤姆N： P-型離子泵 V-型質(zhì)子泵 F-型質(zhì)子泵 ABC超家族一、P-型離子泵（一）、鈉鉀泵構(gòu)成：由2個(gè)大亞基、2個(gè)小亞基組成的4聚體，實(shí)際上就是Na+-K+-ATP酶，分布于動(dòng)物細(xì)胞的質(zhì)膜。工作原理：Na+-K+ATP酶通過磷酸化和去磷酸化過程發(fā)生構(gòu)象的變化，導(dǎo)致與Na+、K+的親和力發(fā)生變化。在膜內(nèi)側(cè)Na+與酶結(jié)合，激活A(yù)TP酶

50、活性，使ATP分解，酶被磷酸化，構(gòu)象發(fā)生變化，于是與Na+結(jié)合的部位轉(zhuǎn)向膜外側(cè)；這種磷酸化的酶對Na+的親和力低，對K+的親和力高，因而在膜外側(cè)釋放Na+、而與K+結(jié)合。K+與磷酸化酶結(jié)合后促使酶去磷酸化，酶的構(gòu)象恢復(fù)原狀，于是與K+結(jié)合的部位轉(zhuǎn)向膜內(nèi)側(cè)，K+與酶的親和力降低，使K+在膜內(nèi)被釋放，而又與Na+結(jié)合。其總的結(jié)果是每一循環(huán)消耗一個(gè)ATP；轉(zhuǎn)運(yùn)出三個(gè)Na+，轉(zhuǎn)進(jìn)兩個(gè)K+。鈉鉀泵對離子的轉(zhuǎn)運(yùn)循環(huán)依賴自磷酸化過程（ATP上的一個(gè)磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到鈉鉀泵的一個(gè)天冬氨酸殘基上，導(dǎo)致構(gòu)象變化），所以這類離子泵叫做P-type。Na+-K+泵的作用：維持細(xì)胞的滲透性，保持細(xì)胞的體積；維持細(xì)胞低Na+

51、高K+環(huán)境，維持細(xì)胞的靜息電位（1/10）；與某些物質(zhì)（如葡萄糖）的跨膜運(yùn)輸有關(guān)。地高辛、烏本苷等強(qiáng)心劑抑制其活性；Mg2+和少量膜脂有助提高于其活性。（二）、鈣泵Ca2+-ATPase有10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，膜內(nèi)側(cè)有第一個(gè)環(huán)有Ca2+離子結(jié)合位點(diǎn)；第二個(gè)上有激活位點(diǎn)，包括ATP的結(jié)合位點(diǎn)。在靜息狀態(tài)，羧基端的抑制區(qū)域同環(huán)2的激活位點(diǎn)結(jié)合，使泵失去功能。Ca2+-ATPase泵有兩種激活機(jī)制：Ca2+濃度升高 Ca2+/鈣調(diào)蛋白復(fù)合物 同抑制區(qū)結(jié)合，釋放激活位點(diǎn)，泵開始工作。反之泵處于靜息狀態(tài)。蛋白激酶C使抑制區(qū)磷酸化，從而失去抑制作用；當(dāng)磷酸酶使抑制區(qū)脫磷酸，抑制區(qū)又同激活位點(diǎn)結(jié)合，起抑制作用。

52、Ca2+ -ATPase的結(jié)構(gòu)和功能位點(diǎn)二、V-型和F-型質(zhì)子泵1V-型質(zhì)子泵：存在于動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)體、溶酶體膜以及植物、酵母和其他真菌細(xì)胞膜上。 利用ATP水解供能從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中逆H+轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞器中。2F-型質(zhì)子泵：主要存在于線粒體內(nèi)膜等上。三、ABC超家族ABC：ATP-binding cassette超家族：一大類家族成員，均在胞質(zhì)側(cè)含2個(gè)高度保守的ABC，可通過結(jié)合ATP發(fā)生二聚化并水解結(jié)合的ATP，造成構(gòu)象變化從而轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)（主要是aa、肽等小分子）。MDR1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器，常在肝癌患者肝中過表達(dá)，造成多藥抗性。四、協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)是一類靠間接提供能量完成的主動(dòng)運(yùn)輸方式。物質(zhì)跨膜運(yùn)動(dòng)

53、所需要的能量來自膜兩側(cè)離子的電化學(xué)濃度梯度，而維持這種電化學(xué)勢的是鈉鉀泵或質(zhì)子泵。動(dòng)物細(xì)胞中常常利用膜兩側(cè)Na+濃度梯度來驅(qū)動(dòng)。植物細(xì)胞和細(xì)菌常利用H+濃度梯度來驅(qū)動(dòng)。根據(jù)物質(zhì)運(yùn)輸方向與離子沿濃度梯度的轉(zhuǎn)移方向，協(xié)同運(yùn)輸又可分為：同向協(xié)同（symport）與反向協(xié)同（antiport）。1、同向協(xié)同（symport）物質(zhì)運(yùn)輸方向與離子轉(zhuǎn)移方向相同。如小腸細(xì)胞對葡萄糖的吸收伴隨著Na+的進(jìn)入。在某些細(xì)菌中，乳糖的吸收伴隨著H+的進(jìn)入。2、反向協(xié)同（antiport）物質(zhì)跨膜運(yùn)動(dòng)的方向與離子轉(zhuǎn)移的方向相反，如動(dòng)物細(xì)胞常通過Na+/H+反向協(xié)同運(yùn)輸?shù)姆绞絹磙D(zhuǎn)運(yùn)H+，以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的PH值。還有一種機(jī)制

54、是Na+驅(qū)動(dòng)的Cl-HCO3-交換，即Na+與HCO3-的進(jìn)入伴隨著Cl-和H+的外流，如存在于紅細(xì)胞膜上的帶3蛋白。五、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)與膜電位1、膜電位靜息電位：細(xì)胞在安靜狀態(tài)下于細(xì)胞膜上形成的外正內(nèi)負(fù)的電位差。形成機(jī)理：靜息狀態(tài)下，質(zhì)膜上鉀離子滲透通道對鉀離子通透性高，使胞內(nèi)高濃度鉀例子滲透到胞外，造成胞外大量正電荷和胞內(nèi)負(fù)電荷的積累，形成穩(wěn)定的電位差。膜的極化：靜息狀態(tài)下這種外正內(nèi)負(fù)的電荷分布我們稱之為膜的極化。l 動(dòng)作電位去極化：當(dāng)細(xì)胞受到閾（或閾上）值電位刺激后，膜上Na離子通道開放，大量Na離子短時(shí)間內(nèi)流使靜息電位減少甚至消失。反極化：隨著Na離子的進(jìn)一步瞬間內(nèi)流，質(zhì)膜處電位由原來的外正內(nèi)負(fù)的靜息狀態(tài)變?yōu)閮?nèi)正外負(fù)的動(dòng)作電位。超極化：隨著動(dòng)作電位的出現(xiàn)，質(zhì)膜上Na離子通道逐漸失活，而鉀離子電壓閘門通道開放大量外流使膜再度極化，以致于超過原來的靜息電位。超極化使K離子通道關(guān)閉，膜重新回到靜息狀態(tài)。動(dòng)作電位的成因在安靜狀況下受到一次短促的閾刺激或閾上刺激時(shí)，膜內(nèi)原來存在的負(fù)電位將迅速消失，并且進(jìn)而變成正電位，由原來的內(nèi)負(fù)外正變?yōu)閮?nèi)正外負(fù)。整個(gè)膜內(nèi)外電位變化的幅度應(yīng)是100mV，這構(gòu)成了動(dòng)作電位變化曲線的上升支；由刺激所引起的這種膜內(nèi)外電位的倒轉(zhuǎn)只是暫時(shí)的，很快就出現(xiàn)膜內(nèi)電位的下降，并恢復(fù)到原有的負(fù)電位狀態(tài)，這構(gòu)成了動(dòng)作電位曲線的