實(shí)驗(yàn)報告：線蟲RNA干擾的基因沉默

1、實(shí)驗(yàn)一：線蟲RNA干擾的基因沉默一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康腞NA干擾(RNAinterference,RNAi)是一種使基因使失活的有效方法，在線蟲中，RNA干擾因?yàn)楹唵味蔀檠芯炕蚬δ艿挠行侄?。我們利用表達(dá)tag-214dsRNA的大腸桿菌喂食線蟲來介導(dǎo)RNAi，以達(dá)到鑒定tag-214基因功能的目的。二、實(shí)驗(yàn)背景RNAi是近年來以秀麗線蟲的研究為基礎(chǔ)而發(fā)展起來的一種基因knockdown技術(shù)，將體外合成的含有目的基因的dsRNA通過某種方式引入到線蟲體內(nèi)，導(dǎo)致其體內(nèi)相應(yīng)的目的基因mRNA降解，從而達(dá)到基因沉默的目的。三、實(shí)驗(yàn)原理通過顯微注射dsRNA或者把線蟲浸入到含有dsRNA的溶液中，或者用能夠

2、表達(dá)dsRNA的大腸桿菌喂食線蟲，可以將dsRNA導(dǎo)入大腸桿菌中。在大腸桿菌HT115中，含有目的基因發(fā)夾結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒，在IPTG的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄出正義和反義的RNA,兩條RNA鏈通過退火形成dsRNA。當(dāng)線蟲以此大腸桿菌為食時，就攝取了大腸桿菌合成的dsRNA，并觸發(fā)了線蟲體內(nèi)RNA干擾的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)將利用表達(dá)tag-214dsRNA的大腸桿菌喂食線蟲來介導(dǎo)RNAi，以達(dá)到鑒定tag-214基因功能的目的。四、實(shí)驗(yàn)材料：.秀麗線蟲(C.elegans)rrf-3突變體(RNAi敏感型)由于線蟲的RNA的干擾操作簡單快速，且重復(fù)性好，已成為鑒定基因功能以及基因間互相作用關(guān)系的有效材料。秀麗線蟲屬于線

3、性動物門，線蟲綱，小桿線蟲目，廣桿線蟲屬。秀麗線蟲是一種生活在土壤中的線蟲，長約1mm，直徑70um，由959個細(xì)胞組成。秀麗線蟲具有雌雄同體和雄性個體兩種性別。雌雄同體的線蟲有兩條X染色體和5對常染色體。其基因組大小為80Mb，包含13000個基因。XXhermaphroditeNaClNaCl1%1mol/LCaCl1mol/LCaCl21.0ml圖為秀麗線蟲的生活史。線蟲具有生活周期短，易培養(yǎng)和保存等優(yōu)點(diǎn)，由于其身體透明，因此可以在顯微鏡下跟蹤觀察每個細(xì)胞的命運(yùn)，是目前遺傳學(xué)、發(fā)育學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的重要模式生物。.大腸桿菌野生型菌株OP50菌株OP50是一種尿嘧啶缺陷型大腸桿菌，它涂布

4、于NGM培養(yǎng)基上，由于該種大腸桿菌是尿嘧啶缺陷型，只能從NGM中獲取尿嘧啶，無法自身合成。所以生長速度會比普通的大腸桿菌慢很多，這樣既可以提供線蟲食物，又不會過度生長。如果用普通的大腸桿菌，由于沒有限制，會過度生長，而且濕度，氧氣已經(jīng)各種環(huán)境因素會制約線蟲的生長。.帶有tag-214發(fā)夾結(jié)構(gòu)質(zhì)粒的HT115菌株將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌HT115,在IPTG誘導(dǎo)下成功獲得目的基因?qū)?yīng)的雙鏈RNA。五、實(shí)驗(yàn)試劑：.NGM普通固體培養(yǎng)基（1L配方）TOC o 1-5 h zNaCl3.0g細(xì)菌蛋白胨16.0g蒸餾水1.0L瓊脂16.0g1mol/LMgSO41.0ml高壓滅菌后加入下列溶劑（每組分

5、配以上溶液250ml）膽固醇250rL1mol/L磷酸鉀緩沖液6.25ml配方（1KH2PO4129.25gK2HPO451.75g.含有氨芐青霉素和IPTG的NGM固體基（用于RNAi）（1L配方）TOC o 1-5 h zNaCl3.0g細(xì)菌蛋白胨2.5g蒸餾水974ml酵母提取物0.8g瓊脂17.0g1mol/LMgSO441.0ml1mol/LCaCl221.0ml高壓滅菌后加入下列溶劑（每組分配以上溶液250ml）膽固醇250rL1mol/L磷酸鉀緩沖液6.25ml配方（1KH2PO4129.25gK2HPO451.75g1mol/L氨芐青霉素1.2mlIPTG的終濃度達(dá)到4mmol

6、/L.LB液體培養(yǎng)基（1L配方）牛肉膏蛋白胨1%酵母提取物0.5%TOC o 1-5 h z加蒸餾水補(bǔ)足1L.M9緩沖液(11配方)Na2hpo45.8gKH2PO43.0gNacl1.0g蒸餾水1.0L.氨芐青霉素和四環(huán)素抗生素氨芐青霉素(100mg/ml)四環(huán)素(100mg/ml)六、實(shí)驗(yàn)器材：天平實(shí)體顯微鏡酸度計水浴鍋超凈工作臺滅菌鍋恒溫?fù)u床恒溫生化培養(yǎng)箱常溫臺式離心機(jī)七、實(shí)驗(yàn)步驟第一天詁配制實(shí)驗(yàn)試劑，并在超凈工作臺中配制NGM固體培養(yǎng)基和用于用于RNAi的NGM固體培養(yǎng)基.ii活化大腸桿菌OP50，挑取少量菌于3mlLB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37震蕩培養(yǎng)20h左右.第二天.鋪菌，將200rL的

7、OP50菌液接入到60nm的NGM平板中央，順時針方向晃動平板使菌液盡量均勻分布在平板上，室溫下放置干燥.活化大腸桿菌HT115,方法同上，將control和帶有tag-214基因的分別做好標(biāo)記.第三天i,#10-20只rrf-3突變體的線蟲接到鋪有OP50的NGM平板上，在培養(yǎng)皿蓋側(cè)面標(biāo)上線蟲名稱和日期，然后被放入到溫箱中，20恒溫培養(yǎng).再次活化HT115菌體，即從之前活化的菌液中control和tag-214的分別取30匹菌液加入到3mlLB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37震蕩培養(yǎng)20h左右.第四天i.鋪菌，分別將200匹的HT115的control和tag-214的菌液接入到60nm的NGM平板中央，

8、順時針方向晃動平板使菌液盡量均勻分布在平板上，室溫下放置干燥第五天i.首先在實(shí)體鏡下觀察線蟲的生長狀況，當(dāng)NGM平板上有較多的成蟲時，可以進(jìn)行以下操作：取3ml的M9緩沖液加入到NGM平板上，反復(fù)輕輕地晃動平板，將平板上的線蟲沖洗下來，然后將含有線蟲的M9緩沖液轉(zhuǎn)移到15ml的離心管中行.向離心管中加入2ml的nacloro溶液和1ml的naoh溶液，之后馬上蓋緊蓋子，劇烈晃動離心管。當(dāng)發(fā)現(xiàn)溶液中的線蟲身體呈現(xiàn)彎曲狀，并且還沒有出現(xiàn)絮狀物時，加入乂9緩沖液至11ml,以終止反應(yīng)。iii.將離心管放入離心機(jī)中，3000r/min離心1min.由小心棄去上清液，加入乂9緩沖液至11ml,再次離心3

9、000/口離心1min.V.再重復(fù)上一步。vi.將上清液棄去，留有底部沉淀和少量液體。沉淀中含有線蟲的卵。小心吹打沉淀，并將沉淀滴入未鋪菌的60nm的NGM培養(yǎng)皿的中央，并放入溫箱中20恒溫培養(yǎng)16-20h.第六天i.收獲L1幼蟲。培養(yǎng)16-20h后，NGM平板上的線蟲發(fā)育成L1幼蟲。取500uL的M9緩沖液沖洗平板中的線蟲，并將沖洗下的L1幼蟲放到1.5mL的離心管中。將L1幼蟲平均分為兩份，分別接到大腸桿菌HT115（對照組和實(shí)驗(yàn)組）的平板中。20培養(yǎng)。ii.Singleworm（挑單個蟲）睫毛依次蘸取Naclo、70%乙醇、無菌水/M9緩沖液，在顯微鏡下分別挑取實(shí)驗(yàn)組和對照組的線蟲，分別

10、放在兩個含有OP50的NGM固體培養(yǎng)板上，每個平板里放一定數(shù)目的線蟲。訕觀察RNAi的表型和效率第二天在顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組平板內(nèi)的卵，并在其后的幾天觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組平板內(nèi)的卵是否能孵化成成蟲。并對孵化出的成蟲進(jìn)行一個統(tǒng)計。八、實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們小組觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組平板內(nèi)的卵是否能孵化成成蟲，并對孵化出的成蟲進(jìn)行一個統(tǒng)計。統(tǒng)計結(jié)果如下：實(shí)驗(yàn)組：卵數(shù)幼蟲數(shù)孵化率161935056.54%298447448.17%34112.44%對照組：卵數(shù)幼蟲數(shù)孵化率155754698.03%2232191.40%我們小組將對照組和實(shí)驗(yàn)組的蟲卵數(shù)/接蟲數(shù)取了平均值，并運(yùn)用EXCEL做成了柱狀圖進(jìn)行明顯的比

11、較。1501口對照組實(shí)驗(yàn)組%率化孵1501口對照組實(shí)驗(yàn)組%率化孵我們又對結(jié)果進(jìn)行了方差分析，結(jié)果如下：TestsofBertuveen-SubjectsEffectsDenendentVariabe:卿酷意SourceTpeIIISumofSquaresdfMeanSquareFSia.CorrectedModel1779.152311779.16259,845,016Intercept21576.672121576.672725773.001條件1779.15211779.15259,845,016Error69,468229.729Total23415.2834CorrectedTotal

12、1836.6113aRSquared=.958(AdjustedRSquared=.951)我們小組又收集并分析了其他小組的數(shù)據(jù)和統(tǒng)計，同樣也做了一個方差分析：RNRNAi口controlRNRNAi1.00.8-率0.6-化孵0.40.20.0-DependentVariable:孵化率SourceTypeIIISumofSquaresdfMeanSquareFSig.CorrectedModel5.603a15.603147.321.000Intercept9.25919.259243.460.000條件5.60315.603147.321.000Error1.52140.038Total16.38342CorrectedTotal7.12441a.RSquared=.786(AdjustedRSquared=.781)分析方差結(jié)果如圖：從數(shù)據(jù)以及圖標(biāo)結(jié)果看來，對照組平均產(chǎn)卵比例遠(yuǎn)高于實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)卵比例，說明1廣-214基因有控制線蟲產(chǎn)卵的功能，當(dāng)這種基因被沉默掉后，線蟲的產(chǎn)卵率明顯下降，另一方面也說明此次的RNA干擾實(shí)驗(yàn)做的比較成功，得到了與理論相一致的結(jié)果。但