一氧化氮供體抗腫瘤作用機制的實驗研究進展

一氧化氮供體抗腫瘤作用機制的實驗研究進展

20世紀(jì)70年代，美國新澤西州大學(xué)的murad教授發(fā)現(xiàn)，硝酸甘油等有機亞硝酸鹽應(yīng)在體內(nèi)代謝為氧化氮（no），并應(yīng)充分發(fā)揮血管擴張的作用。1980年,美國紐約州立大學(xué)的Furchgott教授及其合作者在Nature雜志上發(fā)表文章稱,他們發(fā)現(xiàn)了一種可使血管平滑肌松弛的小分子物質(zhì),并將其命名為血管內(nèi)皮細(xì)胞源性舒張因子(endothe-lium-derivedrelaxingfactor,EDRF)。這篇報道在學(xué)術(shù)界引起了廣泛關(guān)注,吸引了包括加州大學(xué)洛杉磯分校Ignarro教授在內(nèi)的許多科學(xué)工作者從事有關(guān)EDRF的研究。長期研究亞硝基化合物藥理作用的Ignarro教授與Furchgott教授開展合作,針對EDRF的藥理作用以及化學(xué)本質(zhì)進行了一系列實驗,確定了內(nèi)皮細(xì)胞釋放的這種小分子物質(zhì)為NO。1992年NO被Science雜志評選為明星分子,而美國科學(xué)家Ignarro、Murad和Fuchgott等由于對NO作為心血管系統(tǒng)信號分子的研究所做的杰出貢獻而榮獲1998年度諾貝爾生理/醫(yī)學(xué)獎。至此,全球醫(yī)學(xué)界、生物學(xué)界以及化學(xué)界掀起了對NO的研究熱潮。NO作為生物體內(nèi)重要的信使分子,參與血管調(diào)節(jié)、神經(jīng)傳遞、炎癥與免疫反應(yīng)等過程,而NO供體可通過多種途徑抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。1no誘導(dǎo)的低氧腫瘤細(xì)胞的生長低氧可通過多種機制導(dǎo)致體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的耐藥性增強、放療敏感性降低及侵襲能力增強,或削弱免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。實體瘤大多處于低氧狀態(tài),這可能是導(dǎo)致其對放射治療及免疫治療產(chǎn)生耐受及預(yù)后不良的原因。實體瘤內(nèi)部的低氧狀態(tài)導(dǎo)致了低氧誘導(dǎo)因子-1a(hypoxia-induciblefactor-1a,HIF-1a)的累積,而HIF-1a可在常氧狀態(tài)下被蛋白酶降解(即遍在蛋白化作用)。遍在蛋白又稱泛素(ubiquitin),它與蛋白質(zhì)發(fā)生依賴于ATP的反應(yīng),致使其末端與蛋白質(zhì)的賴氨酸氨基縮合,這是觸發(fā)蛋白降解的第一步。脯氨酰羥化酶可致HIF-1a結(jié)構(gòu)域中吡咯氨酸羥基化,從而增強HIF-1a與泛素的結(jié)合,加速HIF-1a的降解。在缺氧條件下,HIF-1a的遍在蛋白化作用可因脯氨酰羥化酶的鈍化失活而受到抑制。研究顯示,作為NO供體,硝酸甘油、硝普鈉和硝酸異山梨酯可在體外和體內(nèi)抑制低氧狀態(tài)下的惡性腫瘤細(xì)胞中HIF-1a的累積和激活。來自NO供體中的NO通過與細(xì)胞色素C氧化酶及復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的結(jié)合可抑制線粒體的呼吸。NO可降低細(xì)胞內(nèi)線粒體對氧的消耗,從而增加了胞內(nèi)氧的重新分布和胞漿內(nèi)氧的利用率,而氧的增多使脯氨酰羥化酶激活,HIF-1a在脯氨酰羥化酶作用下被蛋白酶降解,從而增強腫瘤細(xì)胞對放化療的敏感性。腫瘤的低氧微環(huán)境還可使腫瘤細(xì)胞逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)視,而激活NO信號系統(tǒng)可加強免疫系統(tǒng)對腫瘤的殺傷作用。主要組織相容性抗原是一個復(fù)雜的抗原系統(tǒng),編碼這一系統(tǒng)的基因位于同一染色體片段上,是一組緊密連鎖的基因群,稱為主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)。根據(jù)基因在MHC中的位置以及表達蛋白的功能不同,可將此基因分為3類,由Ⅰ類基因表達的蛋白質(zhì)稱為MHCⅠ鏈相關(guān)性分子(MIC),存在于大部分上皮組織腫瘤細(xì)胞表面,它通過其在自然殺傷(NK)細(xì)胞和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表面的NK細(xì)胞活化受體(NKG2D)在腫瘤免疫監(jiān)督中發(fā)揮重要作用。NK細(xì)胞和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞通過表面的NKG2D受體識別腫瘤細(xì)胞表面的MIC,與腫瘤細(xì)胞結(jié)合,殺傷腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞上MIC分子的減少可使腫瘤逃脫免疫監(jiān)督,而低氧可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞表面MIC分子的脫落,并且這與NO信號系統(tǒng)受損有關(guān)。研究表明,低氧可誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞表面MIC分子的脫落,而激活NO信號系統(tǒng)則可抑制低氧的這一作用;與低氧孵育相同,阻止內(nèi)源性NO信號系統(tǒng)同樣可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞表面MIC分子減少;平行實驗顯示,低氧環(huán)境下的腫瘤細(xì)胞可以抵抗白細(xì)胞介素-2激活的淋巴細(xì)胞的殺傷作用,而在NO存在的情況下,腫瘤細(xì)胞可被淋巴細(xì)胞殺死;利用抗MIC的抗體干擾MIC-NKG2D的相互作用,可逆轉(zhuǎn)NO誘導(dǎo)的低氧腫瘤細(xì)胞對淋巴細(xì)胞的敏感性。經(jīng)典的NO信號通路包括如下幾個環(huán)節(jié):NO激活可溶性的鳥苷酸環(huán)化酶(sGC),進而使環(huán)鳥苷酸(cGMP)累積,cGMP再激活下游的蛋白激酶G(PKG),從而導(dǎo)致一系列的磷酸化及去磷酸化等蛋白修飾,產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。研究顯示,sGC抑制劑和PKG抑制劑抑制NO信號通路后,可使一些NO供體抑制腫瘤或者增加化療敏感性的作用減弱,相反,cGMP類似物8-溴-cGMP激活這一通路,則可發(fā)揮與NO供體同樣的抗腫瘤作用,說明NO供體可通過此條信號途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。除了cGMP依賴的作用以外,NO在體內(nèi)與其他分子的反應(yīng)也是NO發(fā)揮生物活性的重要途徑。如NO衍生的活性氧簇(ROS)或NO與ROS反應(yīng)生成的活性氮簇(RNS)可直接作用于DNA而引起細(xì)胞死亡,或者對蛋白質(zhì)進行修飾改變下游的信號通路。RNS包括一氧化氮陰離子(NO-)、過氧化亞硝酸陰離子(ONOO-)、二氧化氮陰離子(NO?22-)以及其他氮氧化合物。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),NO與ROS反應(yīng)所生成的RNS的種類和濃度與胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)以及胞內(nèi)原本存在的RNS的種類和濃度有關(guān)。不同的RNS可能對細(xì)胞的生存或死亡造成不同的影響,而NO供體在體內(nèi)可能產(chǎn)生對細(xì)胞生存或死亡造成不同影響的RNS,因此當(dāng)用NO供體抑制腫瘤細(xì)胞時,必須綜合考慮可能產(chǎn)生的這兩方面作用。2no供體型化合物NO供體型化合物有多種結(jié)構(gòu)類型,而用于抗腫瘤研究較多的NO供體型化合物主要包括有機硝酸酯、硝普鹽、S-亞硝基硫醇和偶氮二醇鹽(diazeniumdiolates)等4類。2.1硝酸甘油和硝酸鹽異山梨酯對單次給藥的敏感性和安全性有機硝酸酯類NO供體主要包括硝酸甘油、硝酸異山梨酯及單硝異山梨酯,其在體內(nèi)可在酯酶的作用下水解釋放NO。有機硝酸酯是治療和預(yù)防心絞痛的常用藥,但是很多實驗也表明,它們可通過多種機制增加腫瘤對化放療的敏感性,并可在一定程度上抑制腫瘤增殖及預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移。人前列腺癌細(xì)胞DU-145在含氧水平為0.5%和20%的環(huán)境下培養(yǎng)24小時后,再與5種不同濃度(3.1～100μmol·L-1)的阿霉素作用1小時,結(jié)果,含氧水平為0.5%的環(huán)境下經(jīng)各濃度阿霉素作用的癌細(xì)胞相對存活率均較含氧水平為20%的環(huán)境下經(jīng)阿霉素(3.125μmol·L-1)作用的癌細(xì)胞增加約2倍。DU-145細(xì)胞與阿霉素(12.5μmol·L-1)作用1小時后,再與硝酸甘油(1μmol·L-1或10和0.1nmol·L-1)和硝酸異山梨酯(0.1nmol·L-1)作用24小時,結(jié)果,其相對存活率較未經(jīng)這兩種NO供體處理的細(xì)胞明顯降低,硝酸甘油(0.1nmol·L-1)還使在低氧條件下的人前列腺癌細(xì)胞PC-3和DU-145以及人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231對紫杉醇(50μmol·L-1)的敏感性增加。給裸鼠皮下注射2×106個人前列腺癌細(xì)胞PC-3后2～3周,待腫瘤體積達到200～250mm3時,分組給藥,一組裸鼠每周2次腹腔注射阿霉素,另一組在此基礎(chǔ)上,加用硝酸甘油透皮貼劑,每天更換1次,給藥5周后,分離腫瘤組織,計算腫瘤體積,結(jié)果,與單用阿霉素組比較,加用透皮貼劑組裸鼠的平均腫瘤體積縮小了40%。與低氧誘導(dǎo)的耐藥性類似,利用sGC抑制劑和PKG抑制劑抑制NO信號通路,能導(dǎo)致癌細(xì)胞對阿霉素的敏感性下降,而由8-溴-cGMP激活NO信號通路,則可使腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性增強。說明小劑量的硝酸甘油和硝酸異山梨酯可能通過釋放NO而激活cGMP通路,從而提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。缺氧可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對放射敏感性降低,而吸入氧和5%二氧化碳的混合氣體可增加嚙齒類動物和人類腫瘤細(xì)胞對放療的敏感性。在鼠類肝腫瘤TLT細(xì)胞移植模型實驗中,采用核磁共振成像及電子順磁共振氧分析法檢測顯示,與吸入氧和5%二氧化碳的混合氣體類似,靜脈注射硝酸異山梨酯,可致腫瘤細(xì)胞中氧和血流供應(yīng)增加,即靜脈注射0.2mg·kg-1硝酸異山梨酯后30分鐘,腫瘤中氧分壓增加了約5mmHg(1mmHg=133.322Pa),血流增加了約4%,提示硝酸異山梨酯可能通過增加腫瘤細(xì)胞中氧的供應(yīng)而提高腫瘤對放療的敏感性。姜輝等利用基因芯片技術(shù)考察硝酸甘油對人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖以及血管生成相關(guān)基因表達的調(diào)控作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),40mg·mL-1硝酸甘油能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長,同時下調(diào)大部分與血管生成相關(guān)的基因;并推測硝酸甘油的這種作用可能導(dǎo)致腫瘤侵襲力的降低。隨后,他們考察了硝酸甘油對C57BL/6小鼠Lewis肺癌模型癌轉(zhuǎn)移的影響,結(jié)果顯示,每只小鼠灌胃給予1.6g·L-1硝酸甘油0.4mL,連續(xù)10天,小鼠癌轉(zhuǎn)移抑制率達52%,且對動物生理機能無明顯影響。2.2snp誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡硝普鈉(SNP,1)是硝普鹽類NO供體的代表,可在體內(nèi)釋放NO(見圖1)而發(fā)揮血管舒張作用,早在20世紀(jì)70年代就已用于高血壓危象患者的急救。曾有研究認(rèn)為,SNP在體外可通過釋放NO,抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或引起細(xì)胞壞死,而NO清除劑能顯著降低SNP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率。但最新的研究表明,SNP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用也可不依賴于NO的釋放,因為實驗顯示SNP和經(jīng)過2天NO釋放的SNP(ex)可相同程度地誘導(dǎo)成神經(jīng)細(xì)胞瘤SH-SY5Y凋亡。因此認(rèn)為,SNP衍生的ROS才是真正導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的活性物質(zhì),而加用氧自由基的清除劑可使ROS減少,下調(diào)p53水平,使SNP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率下降。將亞硝基鐵氰根陰離子與銅的陽離子復(fù)合物結(jié)合得到兩種含結(jié)晶水的化合物({[Cu(H2L)][Fe(CN)5(NO)]}n·2nH2O(化合物Ⅰ)和{[Cu(H2L)]2[Fe(CN)5(NO)]}n·6nH2O(化合物Ⅱ),它們即使在很高的濃度下對人外周血單核細(xì)胞也沒有細(xì)胞毒性,但對人白血病細(xì)胞株CEM和U937卻表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒作用,對CEM細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為10.8和7.5μmol·L-1,對U937的IC50分別為9和6.5μmol·L-1。應(yīng)用流式細(xì)胞儀對化合物的致凋亡作用進行的研究顯示,經(jīng)上述化合物Ⅰ作用6小時的CEM細(xì)胞株其早期凋亡率達28.2%,12小時凋亡率達57.1%,該化合物誘導(dǎo)凋亡的作用非常明顯。2.3與其他含基的物質(zhì)相結(jié)合S-亞硝基硫醇類化合物是生物體內(nèi)普遍存在的物質(zhì),可在生理條件下緩慢持續(xù)釋放NO,而NO在有氧環(huán)境中可以與某些含巰基的物質(zhì)結(jié)合形成S-亞硝基硫醇,且普遍認(rèn)為,S-亞硝基硫醇是NO在體內(nèi)的儲存形式,也是NO在體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用的基本形式。常用作NO供體進行實驗研究的S-亞硝基硫醇主要有S-亞硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)、S-亞硝基半胱氨酸(CYSNO)和S-亞硝基谷胱甘肽(GSNO)。2.3.1順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡大劑量的NO供體SNAP和SNP或者誘導(dǎo)型NO合酶(iNOS)的過表達均可通過絲裂原活化蛋白激酶家族的p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制腫瘤細(xì)胞中存活素的表達,誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3和SKOV-3的凋亡。Caspase-3的活性檢測顯示,高濃度NO供體(0.5mmol·L-1SNAP或1mmol·L-1SNP)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,同時顯著抑制存活素的表達。通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將表達存活素的基因嵌入核糖體,使存活素在細(xì)胞內(nèi)表達,同時應(yīng)用能產(chǎn)生細(xì)胞毒作用劑量的NO供體作用于細(xì)胞,但卻沒有發(fā)現(xiàn)應(yīng)有的細(xì)胞毒作用。NO供體可上調(diào)并激活p38MAPK,而p38MAPK特異性抑制劑SB203580,則可顯著降低NO供體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,并上調(diào)被NO供體抑制的存活素的表達。提示高濃度NO供體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用與抑制存活素的表達有關(guān)。對順鉑敏感的人卵巢癌OV2008細(xì)胞內(nèi)iNOS的蛋白含量高于對順鉑耐受的人卵巢癌C13*細(xì)胞,而順鉑(10μmol·L-1)作用于OV2008細(xì)胞24小時,可使細(xì)胞內(nèi)iNOS的表達水平增加,神經(jīng)元型和內(nèi)皮型NOS(eNOS/nNOS)的表達水平降低,但對C13*細(xì)胞未產(chǎn)生影響,這可能是C13*細(xì)胞產(chǎn)生抗藥性的原因。采用Hoechst33258染色計數(shù)檢測細(xì)胞凋亡時發(fā)現(xiàn),SNAP(400μmol·L-1)作用于上述兩種癌細(xì)胞24小時,可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并增加p53的表達。研究中還發(fā)現(xiàn),C13*細(xì)胞先經(jīng)SNAP(200μmol·L-1)作用24小時,再經(jīng)順鉑(10μmol·L-1)作用24小時,結(jié)果,原本對順鉑耐受的C13*細(xì)胞也發(fā)生了凋亡;OV2008細(xì)胞先經(jīng)iNOS抑制劑1400w(10和100μmol·L-1)作用24小時,再經(jīng)順鉑(5和10μmol·L-1)作用24小時,結(jié)果,細(xì)胞凋亡率較單獨經(jīng)順鉑作用有所降低。提示NO信號通路在順鉑誘導(dǎo)的OV2008細(xì)胞凋亡中起重要作用,NO供體SNAP可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖并增加其對順鉑的敏感性。Chaiswing等用4種人前列腺癌細(xì)胞株DU145、PC-3和RWPE1及其衍生的WPE1-NB26研究了腫瘤細(xì)胞外的氧化還原狀態(tài)對其侵襲能力的影響,結(jié)果顯示,WPE1-NB26細(xì)胞的侵襲性要強于RWPE1細(xì)胞,且WPE1-NB26細(xì)胞培養(yǎng)基中谷胱甘肽還原型與氧化型的比率(GSH/GSSG)大約是RWPE1細(xì)胞培養(yǎng)基的2倍,表明侵襲能力較強的WPE1-NB26細(xì)胞外的氧化還原狀態(tài)發(fā)生了改變;SNAP(100μmol·L-1)可使DU145、PC-3、WPE1-NB26等3種細(xì)胞的侵襲能力分別下降65%、53%和29%,相反,黃嘌呤(4.5μg·mL-1)/黃嘌呤氧化酶(0.6U·mL-1)可致細(xì)胞外的超氧陰離子增加,從而使這3種細(xì)胞侵襲能力分別增強2.2、1.6和1.4倍;將腺病毒介導(dǎo)的超氧化物歧化酶(SOD)基因轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi),96小時后分泌到細(xì)胞外的SOD增加,從而降低了胞外超氧陰離子水平,導(dǎo)致DU145和PC-3細(xì)胞的侵襲能力均降低49%,同時,基質(zhì)金屬蛋白酶的活性降低,細(xì)胞外亞硝酸鹽濃度增加;SNAP則可通過釋放NO,改變前列腺癌細(xì)胞外的氧化還原狀態(tài),從而降低癌細(xì)胞的侵襲能力。2.3.2glut-1細(xì)胞輸注后細(xì)胞內(nèi)糖轉(zhuǎn)運與SNAP相比,人工合成的很多糖苷類SNAP,如葡萄糖-2-SNAP、果糖-2-SNAP、甘露糖-1-SNAP等水溶性增強,且在水溶液中具有較高的穩(wěn)定性。許多實驗還表明,這些糖基化SNAP對一些腫瘤細(xì)胞具有較強的細(xì)胞毒性,甚至有些比SNAP作用更強,人們推測這可能與腫瘤細(xì)胞表面糖類轉(zhuǎn)運體的高表達有關(guān)。最近的研究證實,癌細(xì)胞對葡萄糖-2-SNAP的敏感性與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1(glucosetransporter-1,GLUT-1)密切相關(guān),與葡萄糖偶聯(lián)的SNAP可容易地通過GLUT-1而轉(zhuǎn)移進入細(xì)胞內(nèi)。在富含GLUT-1的惡性膠質(zhì)瘤T98G及缺乏GLUT-1的成骨細(xì)胞瘤143B中進行的實驗考察了葡萄糖-2-SNAP的細(xì)胞毒性,并用免疫印跡和半定量PCR考察GLUT-1基因及其蛋白的表達。結(jié)果顯示,T98G細(xì)胞對葡萄糖-2-SNAP的敏感性高于對SNAP,SNAP和葡萄糖-2-SNAP對143B細(xì)胞的抑制作用很弱;GLUT-1蛋白在T98G細(xì)胞中有較高表達,而在143B細(xì)胞中的表達很少,且兩種細(xì)胞中GLUT-1mRNA水平大約有10倍的差異。提示NO供體可因糖基的加入而增加細(xì)胞毒性,但這依賴于癌細(xì)胞中GLUT-1的表達。2.3.3gsno的細(xì)胞因子細(xì)胞集落形成實驗和MTT實驗表明,單獨使用NO供體GSNO(50和100μmol·L-1),對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的集落形成數(shù)量沒有影響,但可增強3種烷化劑對該腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)是一種多功能的細(xì)胞因子,有3種亞型:TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3,其中TGF-β1是哺乳動物細(xì)胞中含量最多的亞型,且分布廣泛。GSNO可能通過下調(diào)TGF-β1而降低前列腺癌細(xì)胞的惡性程度及侵襲能力。在正常的前列腺組織中,TGF-β1抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡,但臨床研究表明,前列腺癌細(xì)胞中TGF-β1表達的上調(diào)以及患者尿液和血漿中TGF-β1含量的增加與腫瘤細(xì)胞的血管生成和轉(zhuǎn)移密切相關(guān);轉(zhuǎn)染TGF-β1的腫瘤細(xì)胞惡性程度更高,血管發(fā)生能力更強,侵襲力也更強,并可表達更多的基質(zhì)金屬蛋白酶。酶聯(lián)免疫檢測及實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測顯示,正常情況下,人前列腺癌細(xì)胞PC-3MM2和DU145表達有TGF-β1mRNA及其蛋白質(zhì),而在0～1mmol·L-1的劑量范圍內(nèi),GSNO、SNAP和SNP作用于PC-3MM2細(xì)胞48小時,均可劑量依賴性地下調(diào)細(xì)胞中TGF-β1的表達。2.4lats形態(tài)含有[N(O)NO]-官能團的偶氮二醇鹽類化合物現(xiàn)在公認(rèn)的名稱是diazeniumdiolates,簡稱NONOates,包括離子型偶氮二醇鹽以及O2取代的偶氮二醇鹽。離子型偶氮二醇鹽在生理條件下(pH7.4,37℃)不穩(wěn)定,極易釋放NO,半衰期從幾分鐘到幾小時不等。O2取代的偶氮二醇鹽(2)由于取代基的不同可在不同酶的作用下釋放NO(見圖2)。2.4.1政策誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性離子型偶氮二醇鹽主要包括烷基多胺類(如DETA/NO、DEA/NO、SPER/NO、EP/NO)、吡咯烷類(如PYRRO/NO、PROLI/NO)、哌嗪或哌啶類(如PIPERAZI/NO)等。低氧誘導(dǎo)的B16F10鼠黑素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性與cGMP依賴的NO信號系統(tǒng)有關(guān)。B16F10細(xì)胞分別在含氧水平為1%和20%的條件下培養(yǎng)12小時后,給C57Bl/6小鼠靜脈注射,兩周后,處死小鼠,分離肺,在解剖鏡下計數(shù)肺部小瘤結(jié)節(jié)數(shù),結(jié)果顯示,低氧條件下培養(yǎng)的B16F10細(xì)胞其肺轉(zhuǎn)移率較有氧(20%)培養(yǎng)的細(xì)胞增加4倍,而經(jīng)低濃度的硝酸甘油(20pmol·L-1)和DETA/NO(1fmol·L-1)作用后其低氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移活性被抑制。與低氧培養(yǎng)類似,B16F10細(xì)胞在輸注進入小鼠體內(nèi)前,用L-單甲基精氨酸(L-NMMA,0.5mmol·L-1)抑制細(xì)胞中NOS,并在含氧水平為20%條件下培養(yǎng)12小時,結(jié)果顯示,因L-NMMA抑制了B16F10細(xì)胞中NO的生成,當(dāng)細(xì)胞輸入小鼠體內(nèi)后,導(dǎo)致肺部結(jié)節(jié)數(shù)增加了約1.6倍,而當(dāng)細(xì)胞經(jīng)硝酸甘油(0.1nmol·L-1)處理后,因抑制NO生成而誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性被抑制。8-溴-cGMP則可激活NO信號系統(tǒng),從而抑制了腫瘤細(xì)胞向肺部的轉(zhuǎn)移,提示NO通過cGMP依賴的途徑抑制了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。研究顯示,DETA/NO在最大劑量100μmol·L-1下單獨應(yīng)用,對頭頸部鱗狀上皮細(xì)胞癌CCL23細(xì)胞株的抑制率為25.6%,且該細(xì)胞株經(jīng)DETA/NO預(yù)處理后再經(jīng)順鉑作用,可使順鉑的半數(shù)致死劑量(LD50)下降2/3。提示DETA/NO對CCL23細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒作用,并能顯著增加細(xì)胞對順鉑的敏感性。多層培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231經(jīng)DETA/NO(1μmol·L-1)或硝酸甘油(1μmol·L-1)作用24小時,再經(jīng)阿霉素(200μmol·L-1)作用1小時,結(jié)果,與單用阿霉素相比,細(xì)胞死亡率分別增加了33%和47%。表明激活NO信號通路,可顯著降低多細(xì)胞耐受性(multicellularresistance,MCR),即提高了癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性,提示NO通過依賴于cGMP途徑而增強腫瘤細(xì)胞對阿霉素的敏感性。鼠上皮細(xì)胞JB6常被用于鑒別某種分子靶點在腫瘤發(fā)生中的作用,可分為兩類:一類是具有很強惡性轉(zhuǎn)化能力的JB6P+細(xì)胞,另一類是不易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的JB6P-細(xì)胞。當(dāng)使用腫瘤促進劑,如佛波酯、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)或表皮生長因子處理這兩類細(xì)胞后,JB6P+細(xì)胞可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,并在小鼠皮下生成移植瘤,而JB6P-細(xì)胞則無此轉(zhuǎn)化作用。DETA/NO則可抑制TNF-α誘導(dǎo)的JB6P+惡性轉(zhuǎn)化,其高濃度(100μmol·L-1以上)還可直接誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。2.4.2no的釋放和代謝對離子型親核NO供體偶氮二醇鹽氧負(fù)離子位(O2端)的保護很重要,一方面可增加其穩(wěn)定性,另一方面可使其在特定部位釋放NO而發(fā)揮靶向性作用。將PYRRO/NO的O2端與能被前列腺特異性抗原(PSA)識別的三肽片段連接,可提高其靶向性,其在到達前列腺癌細(xì)胞之前是無活性的,只能通過α-胰凝乳蛋白酶或PSA的特異性水解作用而釋放NO,從而殺死癌細(xì)胞,產(chǎn)生抗腫瘤作用。PYRRO/NO的O2端與一些單糖相連所得糖基化前藥能選擇性地累積在實體瘤細(xì)胞和白血病細(xì)胞中,并由腫瘤細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的糖苷酶活化后釋放NO,發(fā)揮抗腫瘤作用。在偶氮二醇鹽O2端以硝基芳香取代基進行取代,所得一系列具靶向選擇性的衍生物能經(jīng)靶細(xì)胞中酶的水解作用而釋放NO,JS-K便是這類化合物的代表,其可在腫瘤細(xì)胞中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transfarase,GST)的作用下釋放NO,具有廣泛的抑制腫瘤作用。應(yīng)用改良的博伊登室法,在3種乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MDA-MB-231/F10和MCF-7/COX-2中進行試驗,考察JS-K對乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響,結(jié)果顯示,JS-K(0.5和1μmol·L-1)使3種細(xì)胞的侵襲能力分別降低了37%和85%、63%和76%以及49%和75%,而不能釋放NO的JS-K類似物JS-43-126對細(xì)胞的侵襲能力沒有影響,表明JS-K的抗癌細(xì)胞侵襲作用依賴于NO的釋放。MTT法實驗顯示,JS-K對治療敏感和不敏感的多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)細(xì)胞株均具有明顯的細(xì)胞毒性,其作用于6種MM細(xì)胞株48小時的IC50為0.3～1.2μmol·L-1,對多藥耐藥的骨髓瘤細(xì)胞株的IC50為2～2.5μmol·L-1;更為重要的是,JS-K在2.5μmol·L-1濃度下對取自正常志愿者的外周血單核細(xì)胞沒有毒性,在5μmol·L-1濃度下對該細(xì)胞的抑制率也僅為20%左右,但卻可殺死絕大多數(shù)的MM細(xì)胞株;JS-K在MM細(xì)