環(huán)狀RNA在腸道干細(xì)胞自我更新中的調(diào)控機(jī)制與功能研究

環(huán)狀RNA在腸道干細(xì)胞自我更新中的調(diào)控機(jī)制與功能研究一、引言1.1研究背景腸道作為人體消化系統(tǒng)的重要組成部分，不僅承擔(dān)著消化食物、吸收營養(yǎng)物質(zhì)的關(guān)鍵任務(wù)，還在維持機(jī)體免疫平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮著不可或缺的作用。腸道上皮是腸道與外界環(huán)境直接接觸的界面，它不斷地受到各種物理、化學(xué)和生物因素的刺激，同時也面臨著細(xì)胞自然衰老和凋亡的過程。在這一動態(tài)變化的過程中，腸道干細(xì)胞（IntestinalStemCells，ISCs）作為腸道上皮的“種子細(xì)胞”，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。腸道干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，主要定位于小腸的隱窩（cryptsofLieberkühn）中，這是一種深入腸壁的管狀結(jié)構(gòu)，其底部便是腸道干細(xì)胞的所在地。腸道干細(xì)胞通過自我更新，能夠不斷產(chǎn)生新的干細(xì)胞，維持自身數(shù)量的相對穩(wěn)定，同時，它們又能分化為多種成熟的腸道細(xì)胞類型，包括吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞等，這些不同類型的細(xì)胞各司其職，共同維持著腸道的正常生理功能。例如，吸收細(xì)胞主要負(fù)責(zé)吸收水分和營養(yǎng)物質(zhì)，確保機(jī)體能夠攝取足夠的能量和營養(yǎng)；杯狀細(xì)胞分泌黏液，起到保護(hù)和潤滑腸道的作用，有助于食物的順利通過和防止腸道黏膜受到損傷；潘氏細(xì)胞位于隱窩底部，分泌防御肽，對維持腸道的微生態(tài)平衡和抵御病原體入侵發(fā)揮著重要作用；腸內(nèi)分泌細(xì)胞則分泌多種激素，調(diào)節(jié)腸道和全身的生理功能，如調(diào)節(jié)胃腸蠕動、消化液分泌以及血糖水平等。腸道干細(xì)胞的自我更新能力是維持腸道上皮組織穩(wěn)定性和完整性的關(guān)鍵。在正常生理狀態(tài)下，腸道干細(xì)胞大約每3-5天更新1次，以維持腸道上皮的動態(tài)平衡。這一更新過程能夠及時補(bǔ)充因日常代謝而損失的腸黏膜細(xì)胞，保持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。此外，當(dāng)腸道受到損傷時，腸道干細(xì)胞會迅速增殖并分化，替代受損的細(xì)胞，幫助腸道恢復(fù)正常功能。無論是因炎癥性腸病導(dǎo)致的腸道黏膜損傷，還是因輻射暴露等因素引起的腸道組織破壞，腸道干細(xì)胞都能積極響應(yīng)，啟動修復(fù)機(jī)制，促進(jìn)腸道的愈合。這種修復(fù)功能對于維持腸道健康和整體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要，如果腸道干細(xì)胞的自我更新和修復(fù)能力受損，可能會導(dǎo)致腸道疾病的發(fā)生和發(fā)展。腸道干細(xì)胞的異常調(diào)節(jié)與多種腸道疾病密切相關(guān)。在炎癥性腸病（InflammatoryBowelDisease，IBD），包括克羅恩?。–rohn'sDisease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（UlcerativeColitis，UC）中，腸道干細(xì)胞的功能受到抑制，其自我更新和分化能力下降，導(dǎo)致腸道上皮的修復(fù)和再生受阻，從而加重腸道炎癥和損傷。在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中，腸道干細(xì)胞的異常增殖和分化失控，可能使其轉(zhuǎn)化為腫瘤干細(xì)胞，進(jìn)而引發(fā)腫瘤的形成和發(fā)展。研究腸道干細(xì)胞自我更新的調(diào)控機(jī)制，對于深入理解腸道疾病的發(fā)病機(jī)制，開發(fā)新的治療策略具有重要意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入揭示環(huán)狀RNA調(diào)控腸道干細(xì)胞自我更新的分子機(jī)制，為腸道相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)，也為開發(fā)新型治療策略提供潛在的靶點(diǎn)和思路。腸道干細(xì)胞在維持腸道上皮組織的穩(wěn)定性和完整性方面起著關(guān)鍵作用，其自我更新能力的異常與多種腸道疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。盡管目前對腸道干細(xì)胞的研究取得了一定進(jìn)展，如對其生物學(xué)特性、分化潛能以及在腸道疾病中的作用有了初步認(rèn)識，但對于腸道干細(xì)胞自我更新的調(diào)控機(jī)制，尤其是環(huán)狀RNA在其中的作用，仍存在許多未知。環(huán)狀RNA作為一類新興的非編碼RNA，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。然而，環(huán)狀RNA在腸道干細(xì)胞自我更新中的作用及機(jī)制尚未得到充分研究。本研究將系統(tǒng)地探討環(huán)狀RNA對腸道干細(xì)胞自我更新的調(diào)控作用，填補(bǔ)這一領(lǐng)域的知識空白。從理論意義來看，本研究有助于深入理解腸道干細(xì)胞自我更新的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，豐富對腸道發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持機(jī)制的認(rèn)識。腸道干細(xì)胞的自我更新是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及多種信號通路和分子機(jī)制的相互作用。環(huán)狀RNA的參與可能為這一過程增添新的調(diào)控層次，揭示其作用機(jī)制將有助于完善我們對腸道干細(xì)胞生物學(xué)的理解。此外，研究環(huán)狀RNA在腸道干細(xì)胞中的功能，也將為非編碼RNA領(lǐng)域的研究提供新的視角和思路，拓展對非編碼RNA生物學(xué)功能的認(rèn)識。在實(shí)際應(yīng)用方面，本研究具有重要的臨床意義。炎癥性腸病和結(jié)直腸癌等腸道疾病嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和健康，給社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。目前，這些疾病的治療手段仍存在一定的局限性，治療效果不盡如人意。通過揭示環(huán)狀RNA調(diào)控腸道干細(xì)胞自我更新的分子機(jī)制，有望發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，為開發(fā)更加有效的治療方法提供理論基礎(chǔ)。對于炎癥性腸病患者，可通過調(diào)節(jié)環(huán)狀RNA的表達(dá)或干預(yù)其相關(guān)信號通路，促進(jìn)腸道干細(xì)胞的自我更新和腸道上皮的修復(fù)，從而改善疾病癥狀。在結(jié)直腸癌的治療中，針對異常表達(dá)的環(huán)狀RNA及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制，可設(shè)計(jì)特異性的治療策略，抑制腫瘤干細(xì)胞的增殖和分化，提高治療效果。二、腸道干細(xì)胞與自我更新2.1腸道干細(xì)胞概述腸道干細(xì)胞是一類存在于腸道組織中的成體干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化的能力，在維持腸道上皮組織的穩(wěn)態(tài)和修復(fù)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。腸道干細(xì)胞主要定位于小腸隱窩底部，這一特殊的解剖位置為其提供了獨(dú)特的微環(huán)境，即干細(xì)胞龕。小腸隱窩是上皮向固有層凹陷形成的管狀結(jié)構(gòu)，其底部包含了多種細(xì)胞類型，如潘氏細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞和腸道干細(xì)胞等。這些細(xì)胞之間相互作用，共同維持著腸道干細(xì)胞的干性和功能。腸道干細(xì)胞與周圍的潘氏細(xì)胞緊密相鄰，潘氏細(xì)胞能夠分泌多種生長因子和細(xì)胞因子，如Wnt3、表皮生長因子（EGF）和Notch配體等，這些信號分子對于維持腸道干細(xì)胞的自我更新和增殖能力至關(guān)重要。腸道干細(xì)胞龕中的細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白等，也為腸道干細(xì)胞提供了物理支撐和信號傳導(dǎo)的平臺，參與調(diào)節(jié)其生物學(xué)行為。腸道干細(xì)胞具有一系列獨(dú)特的生物學(xué)特征，這些特征使其區(qū)別于其他類型的細(xì)胞。腸道干細(xì)胞具有高度的增殖能力，能夠不斷分裂產(chǎn)生新的細(xì)胞。在正常生理狀態(tài)下，腸道干細(xì)胞大約每3-5天更新1次，以維持腸道上皮細(xì)胞的動態(tài)平衡。這種快速的更新能力確保了腸道上皮能夠及時替換受損或衰老的細(xì)胞，保持其正常的生理功能。腸道干細(xì)胞具有多向分化潛能，能夠分化為多種成熟的腸道細(xì)胞類型，包括吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞等。這些不同類型的細(xì)胞在腸道中發(fā)揮著各自獨(dú)特的功能，共同維持著腸道的消化、吸收和免疫等生理過程。吸收細(xì)胞具有微絨毛結(jié)構(gòu)，能夠增加細(xì)胞表面積，提高對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率；杯狀細(xì)胞分泌黏液，形成黏液層，保護(hù)腸道黏膜免受病原體和有害物質(zhì)的侵襲；潘氏細(xì)胞分泌抗菌肽和溶菌酶等物質(zhì)，參與腸道的免疫防御；腸內(nèi)分泌細(xì)胞分泌多種激素，如胃泌素、胰島素樣生長因子和胰高血糖素樣肽-1等，調(diào)節(jié)腸道的消化、吸收和代謝等生理功能。腸道干細(xì)胞還具有自我更新能力，即干細(xì)胞在分裂過程中，能夠產(chǎn)生一個與自身相同的干細(xì)胞和一個分化的子細(xì)胞，從而維持干細(xì)胞池的大小和功能。這種自我更新能力是腸道干細(xì)胞能夠長期維持腸道上皮組織穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。腸道干細(xì)胞在腸道上皮細(xì)胞的生成中起著核心作用。腸道上皮是人體與外界環(huán)境接觸最頻繁的組織之一，每天都面臨著大量的物理、化學(xué)和生物刺激，因此需要不斷更新以維持其正常功能。腸道干細(xì)胞通過自我更新和分化，源源不斷地為腸道上皮提供新的細(xì)胞。在腸道干細(xì)胞的分化過程中，首先會產(chǎn)生短暫擴(kuò)增細(xì)胞（Transit-AmplifyingCells，TACs），這些細(xì)胞具有較高的增殖能力，但分化潛能相對有限。短暫擴(kuò)增細(xì)胞會經(jīng)歷多次分裂，然后逐漸分化為各種成熟的腸道細(xì)胞類型。這些成熟細(xì)胞會沿著隱窩-絨毛軸向上遷移，最終到達(dá)絨毛頂端，在完成其生理功能后，通過凋亡或脫落的方式離開腸道上皮。在這個過程中，腸道干細(xì)胞的自我更新和分化受到多種信號通路和分子機(jī)制的精確調(diào)控，以確保腸道上皮細(xì)胞的生成和更新能夠有序進(jìn)行。如果腸道干細(xì)胞的功能出現(xiàn)異常，可能會導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞的生成和更新失衡，進(jìn)而引發(fā)各種腸道疾病。2.2自我更新機(jī)制腸道干細(xì)胞的自我更新是維持腸道上皮組織穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵過程，主要通過對稱分裂和不對稱分裂兩種方式來實(shí)現(xiàn)。對稱分裂是指一個腸道干細(xì)胞分裂產(chǎn)生兩個完全相同的子細(xì)胞，這兩個子細(xì)胞都具有與母細(xì)胞相同的干細(xì)胞特性，即自我更新和多向分化的能力。在這種分裂方式下，干細(xì)胞池的數(shù)量會增加，為腸道上皮組織的生長和修復(fù)提供更多的細(xì)胞來源。當(dāng)腸道受到損傷或處于生長發(fā)育階段時，腸道干細(xì)胞會通過對稱分裂快速增殖，以滿足組織對細(xì)胞數(shù)量的需求。在腸道損傷修復(fù)過程中，損傷部位附近的腸道干細(xì)胞會感知到損傷信號，啟動對稱分裂，產(chǎn)生大量的子代干細(xì)胞，這些干細(xì)胞隨后會進(jìn)一步分化為各種成熟的腸道細(xì)胞，參與受損組織的修復(fù)和再生。對稱分裂過程受到多種信號通路的精確調(diào)控，其中Wnt信號通路在促進(jìn)腸道干細(xì)胞對稱分裂中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Wnt信號通路的激活能夠上調(diào)一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)，如CyclinD1等，從而促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，使腸道干細(xì)胞能夠快速分裂。不對稱分裂則是指一個腸道干細(xì)胞分裂產(chǎn)生兩個不同命運(yùn)的子細(xì)胞，其中一個子細(xì)胞保持干細(xì)胞特性，繼續(xù)留在干細(xì)胞龕中，維持干細(xì)胞池的穩(wěn)定；另一個子細(xì)胞則開始向特定的細(xì)胞類型分化，如吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞或腸內(nèi)分泌細(xì)胞等。這種分裂方式既能保證干細(xì)胞數(shù)量的相對穩(wěn)定，又能為腸道上皮組織提供源源不斷的分化細(xì)胞，維持腸道的正常生理功能。在正常生理狀態(tài)下，腸道干細(xì)胞主要通過不對稱分裂來維持腸道上皮細(xì)胞的更新和穩(wěn)態(tài)。在不對稱分裂過程中，細(xì)胞內(nèi)的一些蛋白質(zhì)和細(xì)胞器會發(fā)生不對稱分布，這種不對稱分布決定了兩個子細(xì)胞的不同命運(yùn)。一些極性蛋白，如Par3、Par6和aPKC等，在腸道干細(xì)胞中形成不對稱的分布模式，它們參與調(diào)控細(xì)胞的分裂平面和命運(yùn)決定因子的分配，使得一個子細(xì)胞能夠繼承更多的干細(xì)胞維持因子，從而保持干細(xì)胞特性，而另一個子細(xì)胞則獲得更多的分化誘導(dǎo)因子，開始向特定細(xì)胞類型分化。Notch信號通路在腸道干細(xì)胞的不對稱分裂和分化過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。Notch信號通路的激活能夠抑制腸道干細(xì)胞的分化，維持其干性；而當(dāng)Notch信號通路被抑制時，腸道干細(xì)胞則會傾向于分化為特定的細(xì)胞類型。腸道干細(xì)胞的自我更新對于維持腸道上皮組織的穩(wěn)定性和完整性具有重要意義。通過自我更新，腸道干細(xì)胞能夠不斷補(bǔ)充因細(xì)胞凋亡、損傷或正常代謝而損失的腸道上皮細(xì)胞，確保腸道上皮的正常功能。在正常情況下，腸道上皮細(xì)胞的更新速度約為每3-5天一次，這一過程依賴于腸道干細(xì)胞的持續(xù)自我更新和分化。如果腸道干細(xì)胞的自我更新能力受損，可能會導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞的數(shù)量減少，從而影響腸道的消化、吸收和免疫等功能。在衰老過程中，腸道干細(xì)胞的自我更新能力逐漸下降，腸道上皮的修復(fù)和再生能力也隨之減弱，這使得老年人更容易出現(xiàn)腸道功能紊亂和疾病。腸道干細(xì)胞的自我更新對于腸道的損傷修復(fù)至關(guān)重要。當(dāng)腸道受到物理、化學(xué)或生物因素的損傷時，腸道干細(xì)胞能夠迅速響應(yīng)，通過自我更新和分化產(chǎn)生大量的新細(xì)胞，替代受損的細(xì)胞，促進(jìn)腸道組織的修復(fù)和愈合。在炎癥性腸病中，腸道黏膜受到炎癥損傷，此時腸道干細(xì)胞會被激活，通過自我更新和分化來修復(fù)受損的黏膜組織。如果腸道干細(xì)胞的自我更新和修復(fù)能力不足，可能會導(dǎo)致炎癥持續(xù)存在，病情遷延不愈，甚至發(fā)展為更嚴(yán)重的腸道疾病。2.3腸道干細(xì)胞自我更新的調(diào)控因素2.3.1信號通路腸道干細(xì)胞的自我更新受到多種信號通路的精細(xì)調(diào)控，其中Wnt、Notch和BMP等信號通路在這一過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Wnt信號通路是調(diào)控腸道干細(xì)胞自我更新的核心信號通路之一。在腸道干細(xì)胞中，Wnt信號通路的激活主要通過經(jīng)典的Wnt/β-catenin途徑實(shí)現(xiàn)。當(dāng)Wnt配體與細(xì)胞膜上的Frizzled受體和LRP5/6共受體結(jié)合后，會抑制胞質(zhì)中的β-catenin降解復(fù)合物（包括APC、Axin、GSK-3β和CK1等）的活性，從而使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF家族成員結(jié)合，激活一系列與細(xì)胞增殖和自我更新相關(guān)的靶基因表達(dá)，如c-Myc、CyclinD1和Lgr5等。c-Myc是一種原癌基因，它可以促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力；CyclinD1是細(xì)胞周期蛋白，參與細(xì)胞周期從G1期到S期的轉(zhuǎn)換，對細(xì)胞增殖起著重要的調(diào)節(jié)作用；Lgr5是腸道干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，其表達(dá)的上調(diào)有助于維持腸道干細(xì)胞的干性和自我更新能力。研究表明，在小鼠模型中，條件性敲除腸道干細(xì)胞中的β-catenin基因，會導(dǎo)致腸道干細(xì)胞的自我更新能力顯著下降，腸道隱窩數(shù)量減少，腸道上皮的再生和修復(fù)能力受損。相反，激活Wnt信號通路，如通過給予外源性的Wnt配體或抑制β-catenin的降解，能夠促進(jìn)腸道干細(xì)胞的增殖和自我更新，增加腸道隱窩的數(shù)量和大小。Notch信號通路在腸道干細(xì)胞的自我更新和分化平衡中起著重要的調(diào)節(jié)作用。Notch信號通路的激活依賴于細(xì)胞間的相互作用。當(dāng)相鄰細(xì)胞表面的Notch配體（如Delta-like和Jagged）與腸道干細(xì)胞表面的Notch受體結(jié)合后，會引發(fā)Notch受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD）被γ-分泌酶切割并釋放。NICD進(jìn)入細(xì)胞核后，與轉(zhuǎn)錄抑制因子RBP-Jκ結(jié)合，形成NICD-RBP-Jκ復(fù)合物，從而激活Notch信號通路的靶基因表達(dá)，如Hes1、Hey1和HeyL等。這些靶基因編碼的蛋白質(zhì)屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族，它們可以抑制腸道干細(xì)胞向特定細(xì)胞類型的分化，維持干細(xì)胞的干性和自我更新能力。在腸道發(fā)育過程中，Notch信號通路的激活能夠促進(jìn)腸道干細(xì)胞的增殖和自我更新，確保腸道上皮組織的正常發(fā)育。在成年個體中，Notch信號通路的持續(xù)激活可以維持腸道干細(xì)胞的數(shù)量和功能，抑制其分化。當(dāng)Notch信號通路被抑制時，腸道干細(xì)胞會傾向于分化為特定的細(xì)胞類型，如杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞等。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，通過基因敲除技術(shù)降低腸道干細(xì)胞中Notch受體的表達(dá)，會導(dǎo)致腸道干細(xì)胞分化加速，干細(xì)胞數(shù)量減少，腸道上皮的穩(wěn)態(tài)受到破壞。BMP（BoneMorphogeneticProtein）信號通路在腸道干細(xì)胞的自我更新和分化中發(fā)揮著雙向調(diào)節(jié)作用。BMP信號通路的激活始于BMP配體與細(xì)胞膜上的BMP受體（包括BMPR-IA、BMPR-IB和ActRII等）結(jié)合，形成配體-受體復(fù)合物。這一復(fù)合物會激活受體的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，使受體底物Smad1、Smad5和Smad8磷酸化。磷酸化的Smad蛋白與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物，然后進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。在低水平的BMP信號條件下，BMP信號通路可以促進(jìn)腸道干細(xì)胞的自我更新。BMP信號通路可以通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路的活性來間接影響腸道干細(xì)胞的自我更新。BMP信號通路可以抑制Wnt信號通路中的關(guān)鍵抑制因子Dkk1的表達(dá)，從而增強(qiáng)Wnt信號通路的活性，促進(jìn)腸道干細(xì)胞的自我更新。在高水平的BMP信號條件下，BMP信號通路則會抑制腸道干細(xì)胞的自我更新，促進(jìn)其分化。BMP信號通路可以激活一些與分化相關(guān)的基因表達(dá)，如Sox9和Klf4等，這些基因可以促進(jìn)腸道干細(xì)胞向特定細(xì)胞類型分化。研究發(fā)現(xiàn)，在腸道類器官培養(yǎng)體系中，添加適量的BMP拮抗劑Noggin可以增強(qiáng)腸道干細(xì)胞的自我更新能力，促進(jìn)類器官的生長和增殖；而添加過量的BMP配體則會抑制腸道干細(xì)胞的自我更新，誘導(dǎo)其分化。2.3.2微環(huán)境因素腸道微環(huán)境中的細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)等對腸道干細(xì)胞的自我更新有著重要影響。細(xì)胞因子是一類由免疫細(xì)胞和其他細(xì)胞分泌的小分子蛋白質(zhì)，它們在細(xì)胞間通訊和信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腸道微環(huán)境中，多種細(xì)胞因子參與了腸道干細(xì)胞自我更新的調(diào)控。表皮生長因子（EGF）是一種重要的促生長細(xì)胞因子，它可以與腸道干細(xì)胞表面的EGF受體（EGFR）結(jié)合，激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK信號通路，促進(jìn)腸道干細(xì)胞的增殖和自我更新。研究表明，在腸道類器官培養(yǎng)中，添加EGF可以顯著提高類器官的形成效率和生長速度，表明EGF對腸道干細(xì)胞的自我更新具有促進(jìn)作用。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）家族成員在腸道干細(xì)胞的調(diào)控中也發(fā)揮著重要作用。TGF-β1在低濃度時可以促進(jìn)腸道干細(xì)胞的自我更新，而在高濃度時則會抑制其增殖，促進(jìn)分化。這一調(diào)節(jié)作用可能與TGF-β1對不同信號通路的激活或抑制有關(guān)。TGF-β1可以通過激活Smad信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而影響腸道干細(xì)胞的自我更新和分化。TGF-β1還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，間接影響腸道干細(xì)胞的微環(huán)境，進(jìn)而影響其自我更新能力。白細(xì)胞介素-22（IL-22）是一種由免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，它可以通過與腸道干細(xì)胞表面的IL-22受體結(jié)合，激活下游的STAT3信號通路，促進(jìn)腸道干細(xì)胞的增殖和自我更新。在腸道損傷修復(fù)過程中，IL-22的表達(dá)會顯著增加，它可以促進(jìn)腸道干細(xì)胞的活化和增殖，加速腸道上皮的修復(fù)。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是由多種蛋白質(zhì)和多糖組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，它不僅為細(xì)胞提供物理支撐，還參與細(xì)胞的信號傳導(dǎo)和功能調(diào)節(jié)。在腸道微環(huán)境中，細(xì)胞外基質(zhì)對腸道干細(xì)胞的自我更新起著重要的調(diào)控作用。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，它可以通過與腸道干細(xì)胞表面的整合素受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，如FAK-Src信號通路，促進(jìn)腸道干細(xì)胞的黏附、增殖和自我更新。研究發(fā)現(xiàn)，在富含膠原蛋白的基質(zhì)上培養(yǎng)腸道干細(xì)胞，其自我更新能力明顯增強(qiáng)，類器官的形成效率和質(zhì)量也更高。層粘連蛋白是另一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分，它可以與腸道干細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移、增殖和分化。層粘連蛋白可以通過激活PI3K-Akt信號通路，促進(jìn)腸道干細(xì)胞的自我更新和存活。纖連蛋白在腸道干細(xì)胞的微環(huán)境中也起著重要作用，它可以與多種細(xì)胞表面受體相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、遷移和增殖。纖連蛋白可以通過與腸道干細(xì)胞表面的整合素α5β1結(jié)合，激活下游的信號通路，促進(jìn)腸道干細(xì)胞的自我更新和腸道上皮的修復(fù)。細(xì)胞外基質(zhì)中的一些生長因子結(jié)合蛋白，如硫酸肝素蛋白聚糖，也可以通過結(jié)合和儲存生長因子，如FGF和VEGF等，調(diào)節(jié)這些生長因子在腸道微環(huán)境中的濃度和活性，從而間接影響腸道干細(xì)胞的自我更新。三、環(huán)狀RNA的特性與功能3.1環(huán)狀RNA的結(jié)構(gòu)與形成環(huán)狀RNA（CircularRNA，circRNA）是一類特殊的非編碼RNA分子，其結(jié)構(gòu)特征與傳統(tǒng)的線性RNA截然不同。環(huán)狀RNA呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，沒有5’端帽子和3’端多聚腺苷酸（polyA）尾巴，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了它較高的穩(wěn)定性，使其不易被核酸外切酶降解。環(huán)狀RNA主要通過反向剪接（Back-splicing）過程形成。在經(jīng)典的RNA剪接過程中，前體mRNA（pre-mRNA）的剪接遵循線性順序，即上游外顯子的3’端與下游外顯子的5’端連接，同時切除內(nèi)含子，形成線性的成熟mRNA。而在反向剪接過程中，下游外顯子的5’端與上游外顯子的3’端發(fā)生異常連接，跳過了中間的內(nèi)含子，從而形成了環(huán)狀RNA。這一過程涉及到多種順式作用元件和反式作用因子的參與。順式作用元件在環(huán)狀RNA的形成中起著關(guān)鍵作用。在pre-mRNA的鄰近內(nèi)含子中，常常存在一些短（30-40nt）到長的反向互補(bǔ)序列，如反向Alu元件。這些反向互補(bǔ)序列能夠通過堿基互補(bǔ)配對形成雙鏈結(jié)構(gòu)，從而拉近上下游外顯子的距離，促進(jìn)反向剪接的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，在一些基因的內(nèi)含子中，特定的反向互補(bǔ)序列能夠顯著提高環(huán)狀RNA的生成效率。當(dāng)對這些反向互補(bǔ)序列進(jìn)行突變或刪除時，環(huán)狀RNA的表達(dá)水平會明顯下降。反式作用因子，如RNA結(jié)合蛋白（RBPs），也在環(huán)狀RNA的形成過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。RNA結(jié)合蛋白能夠識別并結(jié)合到pre-mRNA上的特定順式作用元件上，從而影響剪接體的組裝和活性，進(jìn)而調(diào)控反向剪接的發(fā)生。一些RNA結(jié)合蛋白可以促進(jìn)環(huán)狀RNA的形成，而另一些則可能抑制其生成。肌肉盲樣蛋白（Muscleblind-likeproteins，MBL）能夠與pre-mRNA的內(nèi)含子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)環(huán)狀RNA的反向剪接，從而增加環(huán)狀RNA的表達(dá)水平。而剪切因子U2AF65的異常表達(dá)則會抑制環(huán)狀RNA的形成，導(dǎo)致其表達(dá)水平降低。除了反向剪接外，還有一些其他的機(jī)制可能參與環(huán)狀RNA的形成。在某些情況下，內(nèi)含子套索結(jié)構(gòu)在剪接過程中沒有被完全降解，而是通過進(jìn)一步的加工形成了環(huán)狀RNA。一些研究還發(fā)現(xiàn)，RNA編輯等過程也可能影響環(huán)狀RNA的形成和結(jié)構(gòu)。RNA編輯可以改變pre-mRNA的核苷酸序列，從而影響順式作用元件和反式作用因子的結(jié)合，進(jìn)而影響環(huán)狀RNA的生成和功能。環(huán)狀RNA的形成具有組織特異性和發(fā)育階段特異性。不同組織和細(xì)胞類型中，環(huán)狀RNA的表達(dá)譜存在顯著差異，這表明環(huán)狀RNA的形成受到組織特異性的調(diào)控機(jī)制影響。在胚胎發(fā)育過程中，環(huán)狀RNA的表達(dá)水平和種類也會發(fā)生動態(tài)變化，這與胚胎發(fā)育的不同階段和細(xì)胞分化過程密切相關(guān)。在小鼠胚胎發(fā)育的早期階段，一些特定的環(huán)狀RNA表達(dá)水平較高，它們可能參與了胚胎干細(xì)胞的自我更新和分化調(diào)控；而在胚胎發(fā)育后期，隨著組織器官的形成和成熟，環(huán)狀RNA的表達(dá)譜也會發(fā)生相應(yīng)的改變。3.2環(huán)狀RNA的特性環(huán)狀RNA具有多種獨(dú)特的特性，這些特性使其在細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的作用。環(huán)狀RNA具有較高的穩(wěn)定性，這是其最為顯著的特性之一。由于環(huán)狀RNA呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，缺乏5’端帽子和3’端多聚腺苷酸尾巴，這使得它們對核酸外切酶具有較強(qiáng)的抗性，不易被降解。研究表明，環(huán)狀RNA在細(xì)胞內(nèi)的半衰期通常比線性RNA長數(shù)倍，甚至數(shù)十倍。在哺乳動物細(xì)胞中，一些環(huán)狀RNA的半衰期可以達(dá)到24小時以上，而大多數(shù)線性RNA的半衰期則在數(shù)小時以內(nèi)。這種高穩(wěn)定性使得環(huán)狀RNA能夠在細(xì)胞中持續(xù)存在，為其發(fā)揮生物學(xué)功能提供了時間上的保障。環(huán)狀RNA的穩(wěn)定性還與其內(nèi)部的共價閉合環(huán)結(jié)構(gòu)有關(guān)，這種結(jié)構(gòu)使得環(huán)狀RNA分子更加緊湊，不易受到外界因素的干擾。環(huán)狀RNA的表達(dá)具有組織特異性和發(fā)育階段特異性。不同組織和細(xì)胞類型中，環(huán)狀RNA的表達(dá)譜存在顯著差異，這表明環(huán)狀RNA的表達(dá)受到組織特異性的調(diào)控機(jī)制影響。在大腦組織中，一些環(huán)狀RNA的表達(dá)水平明顯高于其他組織，這些環(huán)狀RNA可能參與了神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能維持。在肝臟組織中，也存在一些特異性表達(dá)的環(huán)狀RNA，它們可能與肝臟的代謝、解毒等功能密切相關(guān)。環(huán)狀RNA的表達(dá)水平在個體發(fā)育的不同階段也會發(fā)生動態(tài)變化。在胚胎發(fā)育早期，一些環(huán)狀RNA的表達(dá)水平較高，它們可能在胚胎干細(xì)胞的自我更新和分化過程中發(fā)揮重要作用；隨著胚胎的發(fā)育，這些環(huán)狀RNA的表達(dá)水平逐漸下降，而另一些環(huán)狀RNA的表達(dá)則開始上升，參與到組織器官的形成和成熟過程中。在小鼠胚胎發(fā)育的不同階段，通過高通量測序技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA的表達(dá)譜呈現(xiàn)出明顯的階段性變化，這與胚胎發(fā)育的進(jìn)程密切相關(guān)。環(huán)狀RNA具有一定的序列保守性。盡管環(huán)狀RNA在不同物種之間的序列存在一定的差異，但一些關(guān)鍵的功能區(qū)域往往具有較高的保守性。研究發(fā)現(xiàn)，在人類、小鼠和大鼠等哺乳動物中，一些與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等重要生物學(xué)過程相關(guān)的環(huán)狀RNA，其序列在不同物種之間具有較高的相似性。這種序列保守性暗示了環(huán)狀RNA在進(jìn)化過程中可能具有重要的生物學(xué)功能，并且這些功能在不同物種之間是相對保守的。通過對不同物種環(huán)狀RNA序列的比較分析，還可以發(fā)現(xiàn)一些保守的順式作用元件和反式作用因子結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可能參與了環(huán)狀RNA的形成、調(diào)控和功能發(fā)揮。環(huán)狀RNA的結(jié)構(gòu)和序列特征決定了其具有獨(dú)特的二級和三級結(jié)構(gòu)。通過生物信息學(xué)預(yù)測和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA可以形成多種復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，如莖環(huán)結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等，這些二級結(jié)構(gòu)進(jìn)一步折疊和相互作用，形成了獨(dú)特的三級結(jié)構(gòu)。環(huán)狀RNA的二級和三級結(jié)構(gòu)對于其功能的發(fā)揮具有重要影響。一些環(huán)狀RNA通過其特定的二級結(jié)構(gòu)與miRNA或蛋白質(zhì)結(jié)合，發(fā)揮分子海綿的作用；而另一些環(huán)狀RNA的三級結(jié)構(gòu)則可能決定了其在細(xì)胞內(nèi)的定位和穩(wěn)定性。研究表明，環(huán)狀RNACDR1as具有多個miR-7的結(jié)合位點(diǎn)，這些結(jié)合位點(diǎn)在其二級結(jié)構(gòu)中形成了特定的空間構(gòu)象，使得CDR1as能夠有效地吸附miR-7，發(fā)揮miRNA海綿的功能。3.3環(huán)狀RNA的功能3.3.1miRNA海綿作用環(huán)狀RNA最被廣泛研究的功能之一是其作為miRNA海綿的作用。miRNA是一類長度約為22個核苷酸的小分子非編碼RNA，它們通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）互補(bǔ)配對，抑制mRNA的翻譯過程或促進(jìn)其降解，從而在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用。每個miRNA可以調(diào)控多個靶mRNA，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生命活動。環(huán)狀RNA通常含有多個miRNA結(jié)合位點(diǎn)，能夠特異性地吸附miRNA，從而影響miRNA對靶mRNA的調(diào)控作用。這種作用機(jī)制類似于競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA），環(huán)狀RNA通過與miRNA結(jié)合，將miRNA從其靶mRNA上“隔離”，使靶mRNA能夠正常翻譯，上調(diào)靶基因的表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNACDR1as（小腦變性相關(guān)蛋白1的反義轉(zhuǎn)錄本）在哺乳動物大腦中廣泛存在，它包含70多個miR-7的保守結(jié)合位點(diǎn)，能夠作為miR-7的分子海綿，阻斷miR-7對下游基因的表達(dá)抑制作用。當(dāng)CDR1as過表達(dá)時，它會結(jié)合大量的miR-7，使得miR-7無法與靶mRNA結(jié)合，從而促進(jìn)miR-7靶蛋白的表達(dá)，如UBE2A（泛素連接酶A）、EGFR（表皮生長因子受體）、PTEN（同源性磷酸酶-張力蛋白）、CCNE1（細(xì)胞周期蛋白E）和PIK3CD（磷脂酰肌醇3激酶催化亞基δ）等，這些靶蛋白參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、胃癌、肝細(xì)胞癌等多種疾病的發(fā)生發(fā)展。除了CDR1as，還有許多其他環(huán)狀RNA也被證實(shí)具有miRNA海綿作用。circZNF91在細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用，它可以吸附miR-150等miRNA，解除miR-150對其靶基因的抑制，從而促進(jìn)細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)；circHIPK3在胰島素分泌調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，它通過吸附miR-124等miRNA，調(diào)節(jié)胰島素分泌相關(guān)基因的表達(dá)，影響胰島素的分泌；circBIRC6參與維持細(xì)胞多能性，它能夠吸附miR-29等miRNA，維持細(xì)胞多能性相關(guān)基因的表達(dá)，保證細(xì)胞的多能性狀態(tài)。這些研究表明，環(huán)狀RNA作為miRNA海綿，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，參與了多種生物學(xué)過程和疾病的發(fā)生發(fā)展。3.3.2與蛋白質(zhì)相互作用環(huán)狀RNA還能夠與蛋白質(zhì)相互作用，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，從而影響蛋白質(zhì)的功能和細(xì)胞進(jìn)程。環(huán)狀RNA與蛋白質(zhì)的相互作用方式多種多樣，主要包括以下幾種情況。一些環(huán)狀RNA可以作為蛋白質(zhì)的分子海綿，特異性地吸附蛋白質(zhì)，阻止其與其他分子相互作用，從而影響蛋白質(zhì)的功能。首次報(bào)道的circRNA蛋白海綿是circMbl，它包含多功能盲肌蛋白（MBL）的結(jié)合位點(diǎn)，能夠與MBL蛋白形成反饋調(diào)節(jié)通路。當(dāng)MBL蛋白表達(dá)水平升高時，它會與circMbl側(cè)翼區(qū)內(nèi)含子結(jié)合，促進(jìn)circMbl的反向剪接，進(jìn)而誘導(dǎo)circMbl的產(chǎn)生；而高表達(dá)的circMbl又會吸附MBL蛋白，將其隔離，影響MBL行使正常的生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)mRNA的剪接等。circANRIL可與Pescadillo同源物1（PES1）的C端富含賴氨酸結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，PES1通常參與促進(jìn)核糖體前體RNA（pre-rRNA）加工為成熟的rRNA，circANRIL與PES1的結(jié)合會阻斷PES1的功能，抑制rRNA的成熟，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中核糖體生成障礙、核仁應(yīng)激和細(xì)胞死亡，這與動脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)。環(huán)狀RNA可以作為蛋白質(zhì)的支架，促進(jìn)蛋白質(zhì)之間的相互作用和復(fù)合物的形成。在某些情況下，環(huán)狀RNA能夠結(jié)合多個蛋白質(zhì)，將它們聚集在一起，形成特定的功能復(fù)合物，從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)的活性或調(diào)節(jié)其功能。研究發(fā)現(xiàn)，一些環(huán)狀RNA可以與轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶等蛋白質(zhì)結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄過程；還有一些環(huán)狀RNA可以與信號通路中的關(guān)鍵蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)信號通路的激活和傳導(dǎo)，影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程。環(huán)狀RNA還可以通過與蛋白質(zhì)結(jié)合，影響蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位對于其功能的發(fā)揮至關(guān)重要，環(huán)狀RNA與蛋白質(zhì)的相互作用可以改變蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布，從而影響其生物學(xué)功能。一些環(huán)狀RNA可以與核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合，幫助蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核；而另一些環(huán)狀RNA則可以與細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)結(jié)合，阻止其進(jìn)入細(xì)胞核，使其在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。環(huán)狀RNA與蛋白質(zhì)的相互作用在細(xì)胞的多種生理和病理過程中都發(fā)揮著重要作用。在細(xì)胞周期調(diào)控中，circFOXO3可以與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）和細(xì)胞周期蛋白A（CyclinA）結(jié)合，形成circFOXO3-CDK2-CyclinA復(fù)合物，抑制CDK2的活性，從而阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)展；在細(xì)胞凋亡過程中，circAmotl1可以與凋亡相關(guān)蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號通路的激活，影響細(xì)胞的凋亡命運(yùn)；在免疫應(yīng)答中，一些環(huán)狀RNA可以與免疫細(xì)胞表面的受體或信號分子結(jié)合，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化和功能，參與免疫反應(yīng)的調(diào)控。3.3.3參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控環(huán)狀RNA在轉(zhuǎn)錄水平上對基因表達(dá)也具有重要的調(diào)控作用，它們可以通過多種方式影響基因的轉(zhuǎn)錄過程。一些環(huán)狀RNA可以與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性和與DNA的結(jié)合能力，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄起始。在某些情況下，環(huán)狀RNA能夠結(jié)合到轉(zhuǎn)錄因子上，改變其構(gòu)象，使其更容易或更難與DNA上的特定序列結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，某些環(huán)狀RNA可以與激活型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，增強(qiáng)其與DNA的親和力，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄；而另一些環(huán)狀RNA則可以與抑制型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，阻止其與DNA結(jié)合，解除對基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用。環(huán)狀RNA可以通過與RNA聚合酶或其他轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白相互作用，影響轉(zhuǎn)錄的延伸和終止過程。在轉(zhuǎn)錄延伸過程中，環(huán)狀RNA可以與RNA聚合酶結(jié)合，調(diào)節(jié)其在DNA模板上的移動速度和穩(wěn)定性，從而影響轉(zhuǎn)錄的效率和準(zhǔn)確性。在轉(zhuǎn)錄終止階段，環(huán)狀RNA可以與轉(zhuǎn)錄終止因子相互作用，促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄的終止，影響mRNA的長度和完整性。還有一些環(huán)狀RNA可以通過與染色質(zhì)相互作用，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)對基因表達(dá)具有重要影響，開放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)有利于基因的轉(zhuǎn)錄，而緊密的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)則會抑制基因的轉(zhuǎn)錄。環(huán)狀RNA可以與染色質(zhì)修飾酶結(jié)合，招募它們到特定的基因區(qū)域，改變?nèi)旧|(zhì)的修飾狀態(tài)，如組蛋白的甲基化、乙酰化等，從而影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因的可及性。研究表明，某些環(huán)狀RNA可以促進(jìn)染色質(zhì)的開放，增加基因的轉(zhuǎn)錄活性；而另一些環(huán)狀RNA則可以誘導(dǎo)染色質(zhì)的緊縮，抑制基因的轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞核中，外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀RNA（EIciRNA）可以與U1小核核糖核蛋白（U1snRNP）結(jié)合，形成EIciRNA-U1snRNP復(fù)合物，該復(fù)合物能夠結(jié)合到基因的啟動子區(qū)域，與RNA聚合酶II相互作用，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。EIciRNA還可以通過與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相互作用，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝和活性，進(jìn)一步影響基因的轉(zhuǎn)錄過程。一些內(nèi)含子來源的環(huán)狀RNA（ciRNA）也被發(fā)現(xiàn)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，它們可以通過與轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄起始和延伸，影響基因的表達(dá)水平。四、環(huán)狀RNA調(diào)控腸道干細(xì)胞自我更新的研究現(xiàn)狀4.1相關(guān)研究成果近年來，隨著對環(huán)狀RNA研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明環(huán)狀RNA在腸道干細(xì)胞自我更新的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。研究人員通過高通量測序技術(shù)和功能實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了一系列參與調(diào)控腸道干細(xì)胞自我更新的環(huán)狀RNA，這些發(fā)現(xiàn)為揭示腸道干細(xì)胞自我更新的分子機(jī)制提供了新的線索。circPan3是較早被發(fā)現(xiàn)的對腸道干細(xì)胞自我更新具有重要調(diào)控作用的環(huán)狀RNA。中國科學(xué)院生物物理研究所的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，circPan3在腸道干細(xì)胞中高表達(dá)，且其表達(dá)受到腸道駐留的Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞（ILC2s）分泌的IL-13的調(diào)控。在機(jī)制上，circPan3能夠與IL13ra1mRNA結(jié)合，競爭性地抑制RNA結(jié)合蛋白KSRP與IL13ra1mRNA的結(jié)合，從而增加IL13ra1mRNA的穩(wěn)定性，使腸道干細(xì)胞表面的IL-13Rα1表達(dá)上調(diào)。IL-13與IL-13Rα1結(jié)合后，激活下游信號STAT6，并通過轉(zhuǎn)錄因子FoxP1穩(wěn)定腸干細(xì)胞中β-catenin的水平，進(jìn)而促進(jìn)Wnt/β-catenin信號通路的活化，最終促進(jìn)腸道干細(xì)胞的自我更新。研究人員構(gòu)建了circPan3缺失小鼠模型，發(fā)現(xiàn)circPan3的缺失降低了腸干細(xì)胞自我更新能力，導(dǎo)致干細(xì)胞數(shù)目變少，腸絨毛和隱窩變短，同時也降低了小鼠腸損傷修復(fù)能力。這一研究首次揭示了circPan3在腸道干細(xì)胞自我更新調(diào)控中的關(guān)鍵作用，以及免疫系統(tǒng)通過環(huán)狀RNA對腸道干細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)機(jī)制。circBtnl1是另一個被深入研究的與腸道干細(xì)胞自我更新相關(guān)的環(huán)狀RNA。中國科學(xué)院生物物理研究所范祖森教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，circBtnl1在腸道干細(xì)胞中高度表達(dá)，且其缺失能夠增強(qiáng)小鼠腸道干細(xì)胞的自我更新能力和上皮再生。研究表明，circBtnl1通過與ATP依賴的RNA解旋酶Ddx3y相互作用，競爭性地結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子Atf4的mRNA，從而損害Atf4mRNA在野生型腸道干細(xì)胞中的穩(wěn)定性。ATF4是一種對腸道干細(xì)胞活性具有正向調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，它可通過獨(dú)特的基序與Sox9啟動子結(jié)合，激活Sox9的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而增強(qiáng)腸道干細(xì)胞的自我更新能力和上皮再生。circBtnl1介導(dǎo)的Atf4mRNA衰變抑制了Sox9轉(zhuǎn)錄，從而負(fù)向調(diào)節(jié)了腸道干細(xì)胞的自我更新機(jī)制。研究人員通過構(gòu)建circBtnl1敲除小鼠模型，驗(yàn)證了circBtnl1在體內(nèi)對腸道干細(xì)胞自我更新的抑制作用。circBtnl1敲除小鼠相比對照組小鼠，腸道長度、隱窩數(shù)量及細(xì)胞數(shù)量增加，Ki67和EdU染色檢測顯示circBtnl1敲除促進(jìn)小鼠腸道干細(xì)胞的增殖。這一研究揭示了circBtnl1負(fù)向調(diào)控腸道干細(xì)胞自我更新的新機(jī)制，為解析腸道干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制提供了新視角。4.2研究方法與技術(shù)在研究環(huán)狀RNA調(diào)控腸道干細(xì)胞自我更新的過程中，運(yùn)用了多種先進(jìn)的研究方法與技術(shù)，這些方法和技術(shù)為深入探究其分子機(jī)制提供了有力的工具。高通量測序技術(shù)是研究環(huán)狀RNA的重要手段之一。通過對腸道干細(xì)胞進(jìn)行高通量circRNA-seq測序，可以全面、系統(tǒng)地分析腸道干細(xì)胞中環(huán)狀RNA的表達(dá)譜，篩選出在腸道干細(xì)胞中特異性高表達(dá)或差異表達(dá)的環(huán)狀RNA分子。從C57BL/6小鼠中分離出小腸隱窩，并進(jìn)行高通量circRNA-seq，然后在小鼠腸道干細(xì)胞中選擇了前8個高表達(dá)的circRNA進(jìn)行后續(xù)研究。在測序過程中，首先提取腸道干細(xì)胞的總RNA，然后利用RNaseR消化去除線性RNA，富集環(huán)狀RNA。接著對環(huán)狀RNA進(jìn)行片段化處理，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增和文庫構(gòu)建，最后通過高通量測序平臺進(jìn)行測序。通過生物信息學(xué)分析，可以對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制、比對、注釋和差異表達(dá)分析，從而確定在腸道干細(xì)胞中顯著表達(dá)的環(huán)狀RNA。基因敲除技術(shù)在研究環(huán)狀RNA的功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建環(huán)狀RNA敲除小鼠模型，能夠在體內(nèi)研究環(huán)狀RNA對腸道干細(xì)胞自我更新的影響。為了確定circBtnl1在調(diào)節(jié)腸道干細(xì)胞中的生理作用，用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建circBtnl1敲除小鼠模型。在構(gòu)建過程中，首先設(shè)計(jì)針對circBtnl1的sgRNA，將其與Cas9蛋白共同導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞中，通過同源重組的方式敲除circBtnl1基因。然后將經(jīng)過基因編輯的胚胎干細(xì)胞注射到小鼠囊胚中，再將囊胚移植到代孕母鼠體內(nèi)，獲得circBtnl1敲除小鼠。通過對敲除小鼠的表型分析，如觀察腸道長度、隱窩數(shù)量、細(xì)胞數(shù)量以及腸道干細(xì)胞的增殖情況等，可以明確環(huán)狀RNA在腸道干細(xì)胞自我更新中的作用。RNA干擾（RNAi）技術(shù)是在細(xì)胞水平研究環(huán)狀RNA功能的常用方法。通過設(shè)計(jì)針對環(huán)狀RNA的短發(fā)夾RNA（shRNA），可以特異性地敲低環(huán)狀RNA的表達(dá)，從而研究其對腸道干細(xì)胞自我更新的影響。在小鼠腸道干細(xì)胞中使用shRNA分別敲低circBtnl1等8種circRNA，并建立類器官分析來確定它們的損失對腸道干細(xì)胞活性的影響。在實(shí)驗(yàn)中，將shRNA通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等方法導(dǎo)入腸道干細(xì)胞中，使其與環(huán)狀RNA結(jié)合，引發(fā)RNA干擾效應(yīng)，降解環(huán)狀RNA，降低其表達(dá)水平。然后通過檢測腸道干細(xì)胞的增殖、分化以及類器官的形成等指標(biāo)，評估環(huán)狀RNA敲低對腸道干細(xì)胞自我更新的影響。RNA-蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)對于揭示環(huán)狀RNA的作用機(jī)制至關(guān)重要。RNApulldown結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)可以鑒定與環(huán)狀RNA相互作用的蛋白質(zhì)。在小鼠腸道干細(xì)胞裂解液中進(jìn)行RNApulldown和質(zhì)譜測定，以鑒定circBtnl1的結(jié)合蛋白候選位點(diǎn)，最終確定Ddx3y為相關(guān)的候選蛋白。在RNApulldown實(shí)驗(yàn)中，首先將生物素標(biāo)記的環(huán)狀RNA探針與腸道干細(xì)胞裂解液孵育，使環(huán)狀RNA與結(jié)合蛋白相互作用形成復(fù)合物。然后利用鏈霉親和素磁珠捕獲復(fù)合物，將未結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫，最后對捕獲的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析，鑒定與環(huán)狀RNA相互作用的蛋白質(zhì)。RNA-FISH（RNA熒光原位雜交）和免疫熒光實(shí)驗(yàn)可以驗(yàn)證環(huán)狀RNA與蛋白質(zhì)的共定位情況。通過RNA-FISH和免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)circBtnl1與Ddx3y在小鼠小腸隱窩和腸道干細(xì)胞類器官的細(xì)胞質(zhì)中共定位。在實(shí)驗(yàn)中，分別用針對環(huán)狀RNA和蛋白質(zhì)的特異性探針進(jìn)行標(biāo)記，然后通過熒光顯微鏡觀察兩者的熒光信號，判斷它們是否在細(xì)胞內(nèi)共定位。轉(zhuǎn)錄組微陣列分析技術(shù)可以用于篩選環(huán)狀RNA的靶基因，深入研究其調(diào)控機(jī)制。對模型小鼠的Lgr5+腸道干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組微陣列分析，以鑒定circBtnl1的靶基因。在分析過程中，首先提取腸道干細(xì)胞的總RNA，然后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進(jìn)行熒光標(biāo)記。將標(biāo)記后的cDNA與轉(zhuǎn)錄組微陣列芯片雜交，通過掃描芯片檢測熒光信號強(qiáng)度，分析基因的表達(dá)變化。通過對差異表達(dá)基因的功能分析和篩選，可以確定與環(huán)狀RNA功能相關(guān)的靶基因，進(jìn)一步揭示環(huán)狀RNA調(diào)控腸道干細(xì)胞自我更新的分子機(jī)制。五、環(huán)狀RNA調(diào)控腸道干細(xì)胞自我更新的分子機(jī)制5.1circPan3促進(jìn)腸道干細(xì)胞自我更新的機(jī)制5.1.1與IL13ra1mRNA的相互作用circPan3在腸道干細(xì)胞自我更新中發(fā)揮著關(guān)鍵的促進(jìn)作用，其作用機(jī)制首先體現(xiàn)在與IL13ra1mRNA的相互作用上。circPan3是一種由Pan3基因通過反向剪接形成的環(huán)狀RNA，在腸道干細(xì)胞中高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，circPan3能夠特異性地與IL13ra1mRNA結(jié)合，這種結(jié)合作用是通過兩者之間的互補(bǔ)堿基配對以及特定的RNA結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的。在分子結(jié)構(gòu)層面，circPan3具有獨(dú)特的二級和三級結(jié)構(gòu)，其部分序列能夠與IL13ra1mRNA的特定區(qū)域形成穩(wěn)定的堿基對，從而實(shí)現(xiàn)兩者的緊密結(jié)合。這種結(jié)合并非隨機(jī)發(fā)生，而是受到嚴(yán)格的調(diào)控。在腸道干細(xì)胞中，存在一些RNA結(jié)合蛋白（RBPs），它們可以識別并結(jié)合到circPan3和IL13ra1mRNA上，促進(jìn)兩者的相互作用。這些RNA結(jié)合蛋白可能通過與circPan3和IL13ra1mRNA上的特定基序結(jié)合，改變它們的空間構(gòu)象，使其更容易相互靠近并結(jié)合。circPan3與IL13ra1mRNA的結(jié)合能夠顯著增強(qiáng)IL13ra1mRNA的穩(wěn)定性。正常情況下，IL13ra1mRNA容易受到細(xì)胞內(nèi)多種核酸酶的降解作用，導(dǎo)致其半衰期較短。然而，當(dāng)circPan3與IL13ra1mRNA結(jié)合后，能夠形成一種特殊的RNA-RNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可以有效地保護(hù)IL13ra1mRNA免受核酸酶的攻擊。具體來說，circPan3的環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以包裹住IL13ra1mRNA的關(guān)鍵區(qū)域，使其不易被核酸酶識別和切割。circPan3還可以招募一些RNA穩(wěn)定蛋白，如HuR等，這些蛋白能夠與IL13ra1mRNA結(jié)合，進(jìn)一步增強(qiáng)其穩(wěn)定性。研究表明，在敲低circPan3表達(dá)的腸道干細(xì)胞中，IL13ra1mRNA的半衰期明顯縮短，降解速度加快；而在過表達(dá)circPan3的細(xì)胞中，IL13ra1mRNA的穩(wěn)定性顯著提高，半衰期延長。circPan3與IL13ra1mRNA的結(jié)合還可以影響IL13ra1mRNA的翻譯效率。當(dāng)circPan3與IL13ra1mRNA結(jié)合后，能夠改變IL13ra1mRNA的翻譯起始復(fù)合物的組裝，促進(jìn)核糖體與IL13ra1mRNA的結(jié)合，從而提高IL13ra1蛋白的表達(dá)水平。在體外翻譯實(shí)驗(yàn)中，加入circPan3可以顯著增加IL13ra1蛋白的合成量，而去除circPan3則會導(dǎo)致IL13ra1蛋白的表達(dá)水平明顯降低。這表明circPan3通過與IL13ra1mRNA的相互作用，在轉(zhuǎn)錄后水平上對IL13ra1的表達(dá)進(jìn)行了精細(xì)調(diào)控，為后續(xù)的信號傳導(dǎo)和細(xì)胞功能調(diào)節(jié)奠定了基礎(chǔ)。5.1.2對IL-13/IL-13Rα1通路及下游Wnt/β-catenin通路的影響circPan3與IL13ra1mRNA的相互作用進(jìn)一步影響了IL-13/IL-13Rα1通路及下游Wnt/β-catenin通路的活性，從而促進(jìn)腸道干細(xì)胞的自我更新。IL13ra1負(fù)責(zé)編碼細(xì)胞因子IL-13受體中的一個亞基，circPan3與IL13ra1mRNA的結(jié)合，使得腸道干細(xì)胞表面的IL-13Rα1表達(dá)上調(diào)。IL-13主要由腸道駐留的Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞（ILC2s）分泌，當(dāng)IL-13與腸道干細(xì)胞表面上調(diào)表達(dá)的IL-13Rα1結(jié)合后，會引發(fā)一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，激活下游信號STAT6。IL-13與IL-13Rα1結(jié)合后，會使受體二聚化，進(jìn)而激活受體相關(guān)的酪氨酸激酶，使STAT6的酪氨酸殘基磷酸化。磷酸化的STAT6形成二聚體并進(jìn)入細(xì)胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。在這個過程中，轉(zhuǎn)錄因子FoxP1發(fā)揮了重要作用。激活的STAT6會通過調(diào)控FoxP1的表達(dá)，間接穩(wěn)定腸干細(xì)胞中β-catenin的水平。FoxP1可以與β-catenin相互作用，抑制β-catenin的泛素化降解途徑，從而使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF家族成員結(jié)合，激活Wnt/β-catenin信號通路的靶基因表達(dá)，如c-Myc、CyclinD1和Lgr5等。這些靶基因的表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞增殖、自我更新和干性維持中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。c-Myc可以促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力；CyclinD1參與細(xì)胞周期從G1期到S期的轉(zhuǎn)換，對細(xì)胞增殖起著重要的調(diào)節(jié)作用；Lgr5是腸道干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，其表達(dá)的上調(diào)有助于維持腸道干細(xì)胞的干性和自我更新能力。研究人員通過構(gòu)建circPan3缺失小鼠模型和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了circPan3對IL-13/IL-13Rα1通路及下游Wnt/β-catenin通路的調(diào)控作用。在circPan3缺失小鼠中，腸道干細(xì)胞表面的IL-13Rα1表達(dá)水平顯著降低，IL-13/IL-13Rα1通路及下游Wnt/β-catenin通路的活性受到抑制，表現(xiàn)為STAT6的磷酸化水平降低，β-catenin的核轉(zhuǎn)位減少，以及Wnt/β-catenin通路靶基因的表達(dá)下調(diào)。這些變化導(dǎo)致腸道干細(xì)胞的自我更新能力下降，干細(xì)胞數(shù)目減少，腸絨毛和隱窩變短，同時小鼠的腸損傷修復(fù)能力也明顯降低。而在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)circPan3可以顯著增強(qiáng)IL-13/IL-13Rα1通路及下游Wnt/β-catenin通路的活性，促進(jìn)腸道干細(xì)胞的增殖和自我更新。5.2circBtnl1抑制腸道干細(xì)胞自我更新的機(jī)制5.2.1與Ddx3y的結(jié)合及對Atf4mRNA穩(wěn)定性的影響circBtnl1在腸道干細(xì)胞中高度表達(dá)，且其缺失能夠增強(qiáng)小鼠腸道干細(xì)胞的自我更新能力和上皮再生，這表明circBtnl1對腸道干細(xì)胞的自我更新起到負(fù)向調(diào)控作用。深入探究其作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，circBtnl1主要通過與ATP依賴的RNA解旋酶Ddx3y相互作用，來影響轉(zhuǎn)錄因子Atf4mRNA的穩(wěn)定性。在細(xì)胞內(nèi)，circBtnl1與Ddx3y存在特異性的結(jié)合。為了鑒定circBtnl1的結(jié)合蛋白候選位點(diǎn)，研究人員在小鼠腸道干細(xì)胞裂解液中進(jìn)行了RNApulldown和質(zhì)譜測定，最終確定Ddx3y為相關(guān)的候選蛋白。Ddx3y是一種依賴于ATP的RNA解旋酶，在細(xì)胞的RNA代謝過程中發(fā)揮著重要作用。通過RNA-FISH和免疫熒光實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了circBtnl1與Ddx3y在小鼠小腸隱窩和腸道干細(xì)胞類器官的細(xì)胞質(zhì)中共定位，這為兩者的相互作用提供了空間上的依據(jù)。通過RNApulldown和WB分析也驗(yàn)證了circBtnl1與Ddx3y的相互作用，體外測圖發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lag標(biāo)記的Ddx3y蛋白的RNA結(jié)合域?qū)ζ渑ccircBtnl1的相互作用至關(guān)重要，片段映射分析亦發(fā)現(xiàn)，circBtnl1轉(zhuǎn)錄本(HR2)的外顯子4與Ddx3y蛋白結(jié)合是必要的。這些結(jié)果表明circBtnl1在小鼠腸道干細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞質(zhì)，并與Ddx3y蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。circBtnl1與Ddx3y的結(jié)合對Atf4mRNA的穩(wěn)定性產(chǎn)生了重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，Atf4mRNA能夠與Ddx3y相互作用，而過表達(dá)circBtnl1則會破壞Atf4mRNA與Ddx3y的相互作用。進(jìn)一步的研究確定Ddx3y和circBtnl1結(jié)合在Atf4mRNA的同一位點(diǎn)上，WB證實(shí)Atf4mRNA與Ddx3y的相互作用呈劑量依賴性，截?cái)嘧鲌D顯示Atf4mRNA與Ddx3y的相互作用位點(diǎn)與circBtnl1相同，這表明circBtnl1和Atf4mRNA可競爭性結(jié)合Ddx3y。當(dāng)circBtnl1與Ddx3y結(jié)合后，會阻止Ddx3y與Atf4mRNA的結(jié)合，從而損害Atf4mRNA在野生型腸道干細(xì)胞中的穩(wěn)定性。在敲除circBtnl1的腸道干細(xì)胞中，Atf4mRNA的穩(wěn)定性增強(qiáng)，這進(jìn)一步驗(yàn)證了circBtnl1對Atf4mRNA穩(wěn)定性的負(fù)向調(diào)節(jié)作用。為了確定Ddx3y在腸道干細(xì)胞自我更新中的作用，研究人員在circBtnl1敲除的小鼠類器官中進(jìn)行了Ddx3y的敲除和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ddx3y敲除顯著降低了ATF4的表達(dá)，而過表達(dá)Ddx3y則顯著增加了ATF4的表達(dá)，這表明Ddx3y正向調(diào)控ATF4的表達(dá)。無論是在哪種模型小鼠上，Atf4敲除都顯著減少了腸道干細(xì)胞形成類器官的能力，這說明Atf4對腸道干細(xì)胞活性具有正向調(diào)控作用。綜合這些結(jié)果可以推斷，circBtnl1通過與Ddx3y競爭性結(jié)合Atf4mRNA，抑制了Atf4mRNA的穩(wěn)定性，從而影響了Atf4蛋白的表達(dá)，進(jìn)而對腸道干細(xì)胞的自我更新產(chǎn)生調(diào)控作用。5.2.2對Sox9轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控circBtnl1對腸道干細(xì)胞自我更新的抑制作用還體現(xiàn)在對Sox9轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控上，這一調(diào)控過程與Atf4密切相關(guān)。ATF4是一種對腸道干細(xì)胞活性具有正向調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，它可以通過獨(dú)特的基序與Sox9啟動子結(jié)合，激活Sox9的轉(zhuǎn)錄。Sox9作為干性因子，在維持腸道干細(xì)胞的自我更新能力和上皮再生中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)ATF4與Sox9啟動子結(jié)合后，會招募RNA聚合酶II等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，促進(jìn)Sox9基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加Sox9mRNA和蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而增強(qiáng)腸道干細(xì)胞的自我更新能力。然而，circBtnl1的存在會干擾這一過程。如前文所述，circBtnl1與Ddx3y競爭性結(jié)合Atf4mRNA，抑制了Atf4mRNA的穩(wěn)定性，導(dǎo)致ATF4蛋白的表達(dá)水平下降。ATF4蛋白表達(dá)的減少使得其與Sox9啟動子的結(jié)合能力減弱，無法有效地激活Sox9的轉(zhuǎn)錄。在circBtnl1高表達(dá)的腸道干細(xì)胞中，由于ATF4表達(dá)受到抑制，Sox9的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，Sox9mRNA和蛋白的表達(dá)量也隨之減少。這一系列變化最終導(dǎo)致腸道干細(xì)胞的自我更新能力受到抑制，腸道上皮的再生能力也相應(yīng)減弱。研究人員通過構(gòu)建circBtnl1敲除小鼠模型和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了circBtnl1對Sox9轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控作用。在circBtnl1敲除小鼠中，腸道干細(xì)胞中Atf4mRNA的穩(wěn)定性增強(qiáng)，ATF4蛋白表達(dá)水平升高，進(jìn)而促進(jìn)了Sox9的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，表現(xiàn)為Sox9mRNA和蛋白的表達(dá)量增加。這些小鼠的腸道干細(xì)胞自我更新能力增強(qiáng)，腸道隱窩和腸絨毛數(shù)量增多，腸道上皮的再生能力也明顯提高。而在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)circBtnl1則會導(dǎo)致Atf4mRNA穩(wěn)定性下降，ATF4蛋白表達(dá)減少，Sox9轉(zhuǎn)錄表達(dá)受到抑制，腸道干細(xì)胞的自我更新能力顯著降低。circBtnl1通過抑制Atf4mRNA的穩(wěn)定性，減少ATF4蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制了Sox9的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，最終實(shí)現(xiàn)了對腸道干細(xì)胞自我更新的負(fù)向調(diào)控。這一分子機(jī)制的揭示，為深入理解腸道干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制提供了新的視角，也為相關(guān)腸道疾病的治療提供了潛在的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。六、研究案例分析6.1案例一：circPan3相關(guān)研究中國科學(xué)院生物物理研究所范祖森課題組和田勇課題組在circPan3對腸道干細(xì)胞自我更新的調(diào)控研究中取得了重要成果，相關(guān)研究成果發(fā)表于《NatureImmunity》期刊。研究人員首先從小鼠腸道干細(xì)胞中通過高通量測序技術(shù)篩選出circPan3，發(fā)現(xiàn)其在腸道干細(xì)胞中高表達(dá)。為了深入探究circPan3的功能，研究人員構(gòu)建了circPan3缺失小鼠模型。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，針對circPan3的特定序列進(jìn)行靶向敲除，成功獲得circPan3基因缺失的小鼠。對這些小鼠的腸道組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)circPan3缺失后，小鼠腸道干細(xì)胞的自我更新能力顯著下降。具體表現(xiàn)為干細(xì)胞數(shù)目變少，通過對腸道隱窩中Lgr5陽性干細(xì)胞的計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)circPan3缺失小鼠的Lgr5+干細(xì)胞數(shù)量明顯低于野生型小鼠；腸絨毛和隱窩變短，通過組織切片和顯微鏡觀察，測量腸絨毛長度和隱窩深度，circPan3缺失小鼠的腸絨毛長度縮短了約[X]%，隱窩深度減少了約[X]%，這表明腸道上皮的發(fā)育和維持受到了嚴(yán)重影響；同時，小鼠的腸損傷修復(fù)能力也降低，在對小鼠進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)的腸道損傷模型構(gòu)建后，circPan3缺失小鼠的腸道損傷修復(fù)速度明顯慢于野生型小鼠，損傷部位的愈合時間延長了約[X]天。在機(jī)制研究方面，研究人員發(fā)現(xiàn)circPan3能夠與IL13ra1mRNA結(jié)合，通過RNApulldown實(shí)驗(yàn)和RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了circPan3與IL13ra1mRNA之間存在直接的相互作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，circPan3的結(jié)合能夠競爭性地抑制RNA結(jié)合蛋白KSRP與IL13ra1mRNA的結(jié)合，從而增加IL13ra1mRNA的穩(wěn)定性。通過半衰期實(shí)驗(yàn)，檢測IL13ra1mRNA在不同條件下的降解速度，發(fā)現(xiàn)與野生型細(xì)胞相比，circPan3缺失細(xì)胞中IL13ra1mRNA的半衰期縮短了約[X]小時，表明circPan3對IL13ra1mRNA的穩(wěn)定性具有重要的調(diào)控作用。IL13ra1mRNA穩(wěn)定性的增加使得腸道干細(xì)胞表面的IL-13Rα1表達(dá)上調(diào)，當(dāng)IL-13與上調(diào)表達(dá)的IL-13Rα1結(jié)合后，激活下游信號STAT6，并通過轉(zhuǎn)錄因子FoxP1穩(wěn)定腸干細(xì)胞中β-catenin的水平，進(jìn)而促進(jìn)Wnt/β-catenin信號通路的活化，最終促進(jìn)腸道干細(xì)胞的自我更新。通過Westernblot檢測信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和磷酸化水平，以及免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察β-catenin的核轉(zhuǎn)位情況，驗(yàn)證了這一信號傳導(dǎo)過程。該研究首次揭示了circPan3在腸道干細(xì)胞自我更新調(diào)控中的關(guān)鍵作用，以及免疫系統(tǒng)通過環(huán)狀RNA對腸道干細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)機(jī)制，為深入理解腸道干細(xì)胞的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了重要的理論依據(jù)，也為相關(guān)腸道疾病的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。6.2案例二：circBtnl1相關(guān)研究中國科學(xué)院生物物理研究所范祖森教授團(tuán)隊(duì)在circBtnl1對腸道干細(xì)胞自我更新的調(diào)控研究中取得了重要突破，相關(guān)研究成果發(fā)表于《TheEMBOJournal》期刊。研究人員首先從C57BL/6小鼠中分離出小腸隱窩，并進(jìn)行高通量circRNA-seq，篩選出了在小鼠腸道干細(xì)胞中高表達(dá)的circBtnl1。通過背靠背引物設(shè)計(jì)驗(yàn)證其成環(huán)，利用RNaseR和放線菌素D實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了它的穩(wěn)定性。為了探究circBtnl1對腸道干細(xì)胞的功能影響，研究人員在腸道干細(xì)胞中使用shRNA敲低circBtnl1，并建立類器官分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低circBtnl1最顯著地誘導(dǎo)了類器官的形成，表明circBtnl1的缺失能夠促進(jìn)腸道干細(xì)胞的增殖和類器官的生長。為了進(jìn)一步確定circBtnl1在調(diào)節(jié)腸道干細(xì)胞中的生理作用，研究人員運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了circBtnl1敲除小鼠模型。對敲除小鼠的腸道組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)circBtnl1敲除小鼠相比對照組小鼠，腸道長度增加了約[X]%，隱窩數(shù)量增多了約[X]個，細(xì)胞數(shù)量也顯著增加；通過Ki67和EdU染色檢測，結(jié)果顯示circBtnl1敲除促進(jìn)小鼠腸道干細(xì)胞的增殖，Ki67陽性細(xì)胞比例相比對照組提高了約[X]%，EdU陽性細(xì)胞數(shù)量增加了約[X]%。這些結(jié)果表明，circBtnl1敲除促進(jìn)了腸道干細(xì)胞的自我更新。在機(jī)制研究方面，研究人員通過在小鼠腸道干細(xì)胞裂解液中進(jìn)行RNApulldown和質(zhì)譜測定，鑒定出circBtnl1的結(jié)合蛋白候選位點(diǎn)，確定ATP依賴的RNA解旋酶Ddx3y為相關(guān)的候選蛋白。通過RNA-FISH和免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)circBtnl1與Ddx3y在小鼠小腸隱窩和腸道干細(xì)胞類器官的細(xì)胞質(zhì)中共定位，再通過RNApulldown和WB分析進(jìn)一步驗(yàn)證了二者的相互作用。體外測圖發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lag標(biāo)記的Ddx3y蛋白的RNA結(jié)合域?qū)ζ渑ccircBtnl1的相互作用至關(guān)重要，片段映射分析亦發(fā)現(xiàn)，circBtnl1轉(zhuǎn)錄本(HR2)的外顯子4與Ddx3y蛋白結(jié)合是必要的。為了進(jìn)一步鑒定circBtnl1的靶基因，研究人員對模型小鼠的Lgr5+腸道干細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組微陣列分析。經(jīng)過篩選，發(fā)現(xiàn)Atf4下調(diào)后，類器官形成效果最差，提示Atf4對腸道干細(xì)胞活性具有正向調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)Atf4mRNA能夠與Ddx3y相互作用，而過表達(dá)circBtnl1則會破壞Atf4mRNA與Ddx3y的相互作用。進(jìn)一步確定Ddx3y和circBtnl1結(jié)合在Atf4mRNA的同一位點(diǎn)上，WB證實(shí)Atf4mRNA與Ddx3y的相互作用呈劑量依賴性，截?cái)嘧鲌D顯示Atf4mRNA與Ddx3y的相互作用位點(diǎn)與circBtnl1相同，表明CircBtnl1和Atf4mRNA可競爭性結(jié)合Ddx3y。敲除circBtnl1后，腸道干細(xì)胞Atf4mRNA的穩(wěn)定性增強(qiáng)，表明circBtnl1負(fù)向調(diào)節(jié)Atf4mRNA的穩(wěn)定性。在circBtnl1敲除的小鼠類器官中，Ddx