畢業(yè)論文-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳染色方法的改進(jìn)38776.doc

編號(hào)： 2011 屆本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳 染色方法的改進(jìn) 學(xué) 院 生 命 科 學(xué) 學(xué) 院 專 業(yè) 生 物 科 學(xué) 學(xué) 號(hào) 200740810235 姓 名 孫 靜 芳 指導(dǎo)教師 姬 云 濤 職稱 副教授 完成日期 2011 年 5 月 ii 目 錄 摘 要 .1 關(guān)鍵詞 1 abstract 1 keywords1 引言 1 1. 材料與方法 .2 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 2 1.1.1 試劑 2 1.1.2 主要儀器、設(shè)備 2 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2 1.2.1 溶液的配制 2 1.2.2 制膠 3 1.2.3 電泳 4 1.2.4 染色 5 傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色法 5 水浴加熱法 5 微波爐加熱法 5 1.2.5 染色結(jié)果觀察 6 2. 結(jié)果與分析 .6 2.1 染色效果與操作的簡便性 6 2.2 不同染色方法凝膠成像結(jié)果 7 2.3 染色時(shí)間 7 3結(jié)論與討論 .8 參考文獻(xiàn) 8 致 謝 10 1 sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳染色方法的改進(jìn) 姓名：孫靜芳 學(xué)號(hào)：200740810235 指導(dǎo)教師：姬云濤 （07 級(jí)生物科學(xué) 2 班） 摘 要：針對傳統(tǒng)的sds- page染色法耗時(shí)長，脫色所用甲醇有毒，乙醇會(huì)同時(shí)把考馬斯亮藍(lán)顏色脫去， 使蛋白質(zhì)條帶不清晰等問題，對常染法進(jìn)行了改進(jìn)。本文用水浴或微波加熱處理，同時(shí)改變?nèi)旧汉兔撋?液成分，用乙醇、蒸餾水代替甲醇，大大縮短了染脫時(shí)間，經(jīng)過比較，認(rèn)為改進(jìn)后的水浴法所耗時(shí)間大大 縮短，染色效果也較好。 關(guān)鍵詞：sds - page；考馬斯亮藍(lán)；水浴法；染色；脫色 a modified method for sds-page staining name： sun jingfang student number ：200740810235 dvisor：ji yuntao abstract: for the traditional sds-page time-consuming staining, coomassie brilliant blue color can be taken off by the ethanol used for bleaching, methanol is toxic,the protein bands is not clear, and other issues,an improved method for the common dyeing is coming.by using a water bath or microwave heat treatment, at the same time changing the composition of dyeing and bleaching liquid,ethanol,distilled water instead of methanol,reducing the time of dyeing off greatly.by comparision,that the bathing method improved reduces the time significantly, dyeing better. keywords：sds- page；coomassie brilliant blue；water bathing ；staining； decolorization 2 引 言 繼人類基因組計(jì)劃之后，蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為21世紀(jì)生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)， 對蛋白質(zhì)高分辨率的分離和準(zhǔn)確鑒定變得至關(guān)重要。目前分離蛋白質(zhì)的主要方 法之一就是采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（sds- polyacrylamide gel electrophoresis, sds- page），它的支持介質(zhì)是三維網(wǎng)狀的聚丙烯酰胺凝膠。 在催化劑的作用下，單體丙烯酰胺（acrylamide ， acr）與n ，n-甲叉雙丙烯酰 胺（n,n-methylene bisacrylsmide，交聯(lián)劑 ，bis ）發(fā)生聚合反應(yīng)，生成凝膠介 質(zhì)。由于不同蛋白質(zhì)分子大小和所帶電荷的不同，從而對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，而 分離后的電泳凝膠檢測的染色方法也有多種，其中考馬斯亮藍(lán)染色法由于具有 很強(qiáng)的特異性、較少的干擾因素、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，而成為蛋白質(zhì)電泳檢測和 定量分析的一種常用方法。常用的考馬斯亮藍(lán)有g(shù)-250，r350，和r-250三種， 在游離狀態(tài)下，考馬斯亮藍(lán)g-250為紅色，其最大吸收值為488 nm；而它與蛋白 質(zhì)結(jié)合后顏色由紅色變?yōu)榍嗌?，?95 nm 波長下二者的結(jié)合物光吸收最大，光 吸收值和蛋白質(zhì)的含量成正比關(guān)系，所以可用于蛋白質(zhì)的定量測定 1?？捡R斯 亮藍(lán)g-250 是快染，能與 蛋白質(zhì)迅速進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，約 2 min 即可達(dá)到平衡；它 們的結(jié)合物在室溫下1 h 內(nèi)保持穩(wěn)定。 一般情況下傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色法染脫 時(shí)間較長，約 6 24 h2 ，同時(shí)在多次漂洗、換液的過程中，凝膠表面容易被 污染 3，而且凝膠中的 sds會(huì)干擾考馬斯亮藍(lán)和蛋白質(zhì)的結(jié)合，使染色效果受 到影響。同時(shí)常染所用的甲醇易揮發(fā)，在人體代謝作用下會(huì)轉(zhuǎn)化為甲酸，進(jìn)而 在人眼睛部位積累，對視神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行破壞，危害操作者健康 4。 本文采用考馬斯亮藍(lán)g-250進(jìn)行染色，通過水浴和微波熱處理法，對傳統(tǒng)的 考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行改進(jìn)，以期達(dá)到大大縮短凝膠染色、脫色時(shí)間，從而使 操作更簡便，所用試劑更少，成本更低，更有利于操作者的健康的目的。 1. 材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1.1 試劑 濃硫酸，甘油，巰基乙醇，n,n,n,n四甲基乙二胺（temed） ，濃縮膠緩 沖液（1 m的tris-hcl ph 6.8） ，無水乙醇，冰乙酸，雙蒸水，牛血清白蛋白 （68 kb） ，考馬斯亮藍(lán)g-250，丙烯酰胺，n,n-甲叉雙丙烯酰胺，溴酚藍(lán)，十二 3 烷基磺酸鈉(sds)，甘氨酸，tris堿，過硫酸胺。 1.1.2 主要儀器、設(shè)備 直流穩(wěn)壓電源，水平脫色搖床（太倉科技器材廠） ，移液槍，垂直電泳槽， 凝膠成像分析儀（金西盟北京儀器有限公司） ，ph 計(jì)，量筒，燒杯，容量瓶， 電子天平（奧豪斯儀器上海公司） ，低溫冰箱(合肥美菱有限公司)，雙蒸水蒸餾 器，灌膠支架，電磁爐（九陽股份有限公司） ，水浴鍋，微波爐等。 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 1.2.1 溶液的配制 5 30 %的丙烯酰胺 用電子天平分別稱取丙烯酰胺29.2 g，n,n亞甲基雙丙烯酰胺0.8 g，用 60l熱的雙蒸水溶解，過濾，定容到100 l。 （由于未聚合的丙烯酰胺和甲 叉雙丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作均須戴口罩手套，并在通風(fēng)處進(jìn)行，保存于 棕色瓶中，4 存放。 ） 10%十二烷基硫酸鈉（sds ） 用電子天平稱取10 gsds粉末，于90 ml 雙蒸水中加熱至 68 溶解，定容 至100 ml，室溫保存。 10 %過硫酸胺（ap） 稱取0.5 g過硫酸銨于5 ml雙蒸水中溶解，4保存（需新鮮配制） 。 分離膠緩沖液（1.5 m的tris-hcl ph 8.8） 用電子天平稱取18.16 gtris粉末，于80 ml雙蒸水中溶解， ph計(jì)測量并用濃 鹽酸調(diào)節(jié)ph至8.8，后定容至100 ml，4 保存。 tris-甘氨酸 5 x電泳緩沖液 分別用電子天平稱取6.0 gtris粉末和28.8 g甘氨酸，用 900 ml雙蒸水溶解， 再加入1 gsds，用容量瓶定容至1000 ml 。 5 x上樣緩沖液 分別量取0.6 ml 1m tris-hcl ph6.8緩沖液，5 ml 50%的甘油，2 ml 10 % 的sds，0.5 ml巰基乙醇， 1 ml 1 %溴酚藍(lán)，0.9 ml 雙蒸水，混合，4保存待 用。 蛋白質(zhì)原液的配制 稱取0.1 g的牛血清白蛋白，于100 ml雙蒸水中溶解，即為1000 g/ml 的蛋 4 白質(zhì)原液。 1.2.2 制膠 6 確定所要配制分離膠的濃度和體積。 表 1 sds-page 凝膠的有效分離范圍 丙烯酰胺濃 度（% ） 15 12.5 10 7.5 5.0 蛋白質(zhì)線性 分離范圍（ kda） 15-435 15-60 18-75 30-120 60-212 由于實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量為68 kb，并結(jié)合其他文獻(xiàn)綜合考慮應(yīng)選擇 濃度為10 % 的分離膠。先用洗滌劑分別把玻璃板，樣品梳，space洗凈，雙蒸水 沖洗幾次，吹風(fēng)機(jī)吹干。 把space 安裝到制膠架上，按要求用制膠模安裝并固 定好玻璃板(兩邊均勻用力)，插入梳子后，在距齒底約1 cm的地方用記號(hào)筆做 個(gè)標(biāo)記，去除加樣梳，以有利于目測分離膠灌制的大致位置。 配制8 ml 10 %的分離膠。 表2 分離膠的配制比 temed為加速劑應(yīng)最后加入，燒杯中迅速混合均勻后，向玻璃板間一次性 緩緩灌制分離膠到標(biāo)記處，并立即沿玻璃壁來回移動(dòng)注入一層雙蒸水，水封， 以排空氣 7。約 20 min后在分離膠和水層間出現(xiàn)一清晰界面，即表明膠已聚合 5。 待分離膠聚合完全后，倒去上層雙蒸水，并用濾紙吸干。再配制3.0 ml 6%的濃縮膠。 表3 濃縮膠的配制比 雙蒸水 1 mtris-hcl ph 8.8 緩沖 液 30 % acr-bis 10 % sds 10 % ap 10 % temed 3.0 ml 2.1 ml 2.8 ml 80 l 56 l 6 l 5 雙蒸水 1 mtris-hcl ph 6.8 緩沖 液 30 % acr-bis 10 % sds 10 % ap 10 % temed 2.0 ml 400 l 600 l 36 l 24 l 4 l 加入ap和temed后，迅速混合，將濃縮膠灌制到分離膠上，接近矮板頂 端，立即平行插入樣品梳，避免氣泡，放置30 min-1 h，待膠充分聚合并老化。 1.2.3 電泳 裝好模板（矮板于內(nèi)側(cè)），把膠條去掉并裝入電泳槽中，拔出加樣梳， 用電泳緩沖液沖洗加樣孔。將tris-甘氨酸電泳緩沖液用雙蒸水稀釋5倍，加到電 泳槽中，膠膜內(nèi)側(cè)液面不可超過高板，但要沒過矮板。 加樣 （1）分別取不同濃度梯度 （0.001，0.002，0.004，0.006，0.008，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 g/l ） 的蛋白質(zhì)樣品原液20 l與5 l 5 x樣品緩沖液于離心管中混合，標(biāo)記，用電磁 爐沸水浴加熱處理5-10 min，用移液槍進(jìn)行點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)樣孔的上樣量為5 l。 （2）取相同濃度蛋白質(zhì)樣品原液20 l與5 l5x樣品緩沖液于離心管中混合， 加熱處理5-10 min，進(jìn)行點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)樣孔的上樣量為5 l。 電泳 連接直流穩(wěn)壓電源，打開電源開關(guān)，設(shè)定濃縮膠電壓為75 v ，時(shí) 間50 min，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后電壓改為150 v，時(shí)間 1 h。 電泳結(jié)束后，關(guān)閉電源，取出凝膠模，用鏟子小心撬開玻璃板一側(cè)，凝 膠便貼在其中一塊板上，去除濃縮膠，并切去分離膠一角做標(biāo)記，取下分離膠 于容器中，以待染色。 1.2.4 染色 傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色法 1 （1）固定 將電泳后的凝膠浸泡于200 ml固定液（40 %甲醇，10 %乙酸，用雙蒸水定 容）中，于脫色搖床上輕微震蕩30 min，以充分固定。 （2）放大 將固定后的凝膠浸泡在200 ml 10%的乙酸溶液中，搖床上震蕩20 min。 （3）染色 6 把凝膠浸泡在考馬斯亮藍(lán)g-250染液（0.1 g考馬斯亮藍(lán)g-250 溶解于200 ml 固定液中）中搖床上染色2 h。 （4）脫色 棄去染液（可收集回收利用） ，取出膠并在雙蒸水中漂洗數(shù)次，室溫下用 200 ml脫色液(10 % 甲醇， 10 %乙酸，雙蒸水定容 )，于脫色搖床上震蕩脫色3-4 h，其間換液2-3次，直至背景清晰。 水浴加熱法 （1）電泳后先把膠置于200 ml雙蒸水中，煮沸，于脫色搖床上搖幾分鐘冷卻。 （2）棄去水立即把凝膠放入熱染液中（含染料、乙醇、乙酸） ，脫色搖床上進(jìn) 行染色20 min。 （3）棄去染液后，把膠于沸水浴中脫色兩次，再用200 ml脫色液（10 %乙酸 溶液）常溫脫色10 min，效果更好（染色脫色過程中可在容器上加一層薄膜， 以免試劑揮發(fā)太快，影響染色效果） 。 微波爐加熱法 （1）不經(jīng)固定液固定，電泳后直接把膠浸于200 ml雙蒸水中，用微波爐強(qiáng)火 加熱3 min，稍微冷卻后再重復(fù)一次。 （2）把膠沒于20 0 ml染液中，不含甲醇和冰醋酸，只加考馬斯亮藍(lán)和雙蒸水， 微波爐中加熱3 min，加快染色。 （3）先用雙蒸水把多余的染液洗去，再把凝膠置于200 ml雙蒸水中，微波爐 加熱3 min，冷卻后即完成脫色，暫時(shí)保存于純水中。 1.2.5 染色結(jié)果觀察 把不同染色方法的凝膠轉(zhuǎn)移至凝膠成像分析儀中，打開電源開關(guān)，選擇白光， 底座換為白板，調(diào)節(jié)光線和焦距，直至能清楚看到蛋白質(zhì)條帶，拍照并保存記 錄。 2. 結(jié)果與分析 2.1 染色效果與操作的簡便性 7 圖1 三種染色方法的結(jié)果 注：蛋白質(zhì)上樣量均為5 g/ 孔;a. 傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色; b. 水浴常染結(jié)合法; c. 微波爐加熱法 由圖可知，水浴熱染法較傳統(tǒng)染色法條帶更為清晰，微波爐加熱法背景色太 重，不容易徹底脫去，不易觀察，且容易損壞膠片。另外，傳統(tǒng)染色法脫色所 使用的乙醇有可能會(huì)同時(shí)把考馬斯亮藍(lán)的顏色脫掉，從而使蛋白質(zhì)條帶不清楚， 而水浴和微波法只使用冰乙酸脫色，操作更簡便，更安全。 2.2 不同染色方法凝膠成像結(jié)果 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 8 圖2 3種染色方法的靈敏度檢測 注：1-10號(hào)蛋白質(zhì)上樣量依次為：0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/ 孔;a. 傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色; b. 水浴常染結(jié)合法; c. 微波爐加熱法 定量牛血清白蛋白加熱變性后電泳，分別用三種不同的染色方法：傳統(tǒng)考 馬斯亮藍(lán)染色、水浴常染結(jié)合法、微波爐加熱法對三塊平行的凝膠進(jìn)行染色， 比較三者的靈敏度。由圖中可知，三種方法的靈敏度差異不大，其中水浴法蛋 白質(zhì)測定的靈敏度都為0.1 g / 孔。 2.3 染色時(shí)間 表4 不同染色方法所用時(shí)間比較 時(shí)間 （min） 方法 固定和放大 染色 脫色 總時(shí)間 傳統(tǒng)染色法 水浴加熱法 微波熱染法 50 5 9 120 20 3 至少180 15 3 350 40 15 由表可知，傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色法所耗時(shí)間長達(dá)6 h，甚至需要進(jìn)行過夜脫 9 色；而水浴和微波加熱法大大縮短了染脫時(shí)間，水浴法總消耗時(shí)間40 min，其5 min沸水浴脫色效果和傳統(tǒng)染色的過夜脫色相當(dāng)；微波加熱法更短達(dá)15 min，所 用試劑也較少，可循環(huán)使用。 3結(jié)論與討論 高溫有利于促進(jìn)分子的自由擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，加速試劑向凝膠中擴(kuò)散和滲透。同 時(shí)由于sds 對熱不穩(wěn)定，在 80 以下才相對穩(wěn)定 8，通過水浴或微波熱處理， 使sds-page凝膠的溫度達(dá)到 100 ，從而分解了sds ，解除了sds 對考馬斯 亮藍(lán)染色的扼制，使考馬斯亮藍(lán)染色得以順利進(jìn)行 9；加熱使蛋白質(zhì)被快速固 定，大大節(jié)省了固定和染色時(shí)間，降低了凝膠被污染的機(jī)會(huì)；同時(shí)由于不使用 甲醇，降低了成本，也有利于操作者的身體健康。水浴考馬斯亮藍(lán)染色法檢測 的蛋白質(zhì)靈敏度為0.1 g / 孔。水浴法中固定和染色的時(shí)間可由傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán) 染色法的3 h縮短為25 min，微波加熱法則在10 min左右，但微波爐加熱法凝膠 背景色較深，且容易損壞膠片，不容易把握，適用于蛋白質(zhì)的快速分離。所以， 總體上水浴法操作更簡便快捷，效果更好，可用于蛋白質(zhì)的測定。 參考文獻(xiàn) 1. bradfordmm. a rap id and sensitive method for the quantitation of microgram quantifies of protein utilizing the principle of proteindye binding. anal biochem, 1976, 7: 2482254. 2. chen c q, belanger r r, benhamou n, et al. defence enzymes induced in cucumber roots by treatment with plant growth-promoting rhizobacteria and pythium aphanidermatumj. physiol mol plant pathol, 2000, 56: 13-23. 3. 崔艷麗，王生余， 張真. 微波技術(shù)在尿蛋白譜檢測中的應(yīng)用j. 現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志， 2002,17:35-36. 4. 謝克昌. 甲醇及其衍生物m . 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2002-06. 5. 汪家政，范明. 蛋白質(zhì)技術(shù)手冊m . 北京: 科學(xué)出版社. 2000. 6. 李林，張悅紅. 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2007. 7. merril c r. gel staining techniquesj . methods enzymol ,1990 ,182 :477 - 488. 8. 國家技術(shù)監(jiān)督局. 十二烷基硫酸鈉( gb/ t15963 -1995) s . 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 1996-08-01 9. 葉長青. sds2聚丙烯酰胺凝膠電泳染色方法的改進(jìn). 湖北工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2009，24:16-18. 10 致 謝 在畢業(yè)論文即將完成之際，收獲頗多，感觸良深。論文完成的背后離不開可 愛的親們的支持和幫助。 首先我要感謝我的指導(dǎo)老師姬云濤老師，姬老師嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致、一絲不茍的作風(fēng) 是我在人生路上的榜樣。她在論文的選題以及實(shí)驗(yàn)方面給予了我無私的幫助， 在忙碌的教學(xué)工作中抽出時(shí)間來審查我的論文，指出其中的不足，并不耐其煩 的指導(dǎo)我進(jìn)行論文的修改，在此特向姬老師表示我由衷的感謝； 其次感謝屈長青老師，劉小麗和楊京霞老師，謝謝你們在實(shí)驗(yàn)過程中諸多方 11 面給予我的指導(dǎo)，教會(huì)我科學(xué)的嚴(yán)謹(jǐn)態(tài)度和永不言棄的精神； 也要感謝二樓和我一起做實(shí)驗(yàn)的“戰(zhàn)友們” ，我們一起走過大學(xué)最后的日子， 在一次次“預(yù)實(shí)驗(yàn) ”的失敗之后，我們不斷完善著自己，雖然忙碌但卻很快樂； 同時(shí)還要感謝 07 級(jí)生科二班的兄弟姐妹們，謝謝你們曾經(jīng)給予我的關(guān)心和 幫助，我們滿懷希望，我們一腔熱情，我們是一個(gè)可愛的大家庭。在這到處充 溢著感傷的季節(jié)，在這離別的時(shí)刻，我心中滿是不舍，但我想說“海內(nèi)存知己， 天涯若比鄰” ，我們不曾離開！ 還有我宿舍的姐妹們，感謝你們大學(xué)四年的幫助，在我最悲傷的時(shí)候安慰我， 在我最無助的時(shí)候支持我，快樂的時(shí)候我們一起瘋狂，煩惱的時(shí)候我們一塊分 擔(dān)，是你們給了我溫暖，讓我感受到“家” 的溫馨； 最后要我要感謝我親愛的父母，感謝你們的養(yǎng)育之恩，你們是我力量的源泉， 永恒的動(dòng)力！ 大學(xué)四年即將結(jié)束，回頭望去，有歡笑，有淚水，有遺憾，有感動(dòng)我們一 起攜手走過這最為可貴的四年，最為難忘的四年。曾經(jīng)，我們年少輕狂；現(xiàn)在， 我們?nèi)諠u成熟，我們都在經(jīng)歷華麗的“蛻變” 。大學(xué)，雖然不盡完美，但卻讓我 們學(xué)會(huì)更加珍惜，學(xué)會(huì)勇于追求自己想要的生活！ g an employment tribunal claim employment tribunals sort out disagreements between employers and employees. you may need to make a claim to an employment tribunal if: you dont agree with the disciplinary action your employer has taken against you your employer dismisses you and you think that you have been dismissed unfairly. for more information about dismissal and unfair dismissal, see dismissal. you can make a claim to an employment tribunal, even if you havent appealed against the disciplinary action your employer has taken against you. however, if you win your case, the tribunal may reduce any compensation awarded to you as a result of your failure to appeal. remember that in most cases you must make an application to an employment tribunal within three months of the date when the event you are complaining about happened. if your application is received after this time limit, the tribunal will not usually accept it. if you are worried about how the time limits apply to you, take advice from one of the organisations listed under further help. employment tribunals are less formal than some other courts, but it is still a legal process and you will need to give evidence under an oath or affirmation. most people find making a claim to an employment tribunal challenging. if you are thinking about making a claim to an employment tribunal, you should get help straight away from one of the organisations listed under further help. if you are being represented by a solicitor at the tribunal, they may ask you to sign an agreement where you pay their fee out of your compensation if you win the case. this is known as a damages-based agreement. in england and wales, your solicitor cant charge you more than 35% of your compensation if you win the case. 12 if you are thinking about signing up for a damages-based agreement, you should make sure youre clear about the terms of the agreement. it might be best to get advice from an experienced adviser, for example, at a citizens advice bureau. to find your nearest cab, including those that give advice by e-mail, click on nearest cab. for more information about making a claim to an employment tribunal, see employment tribunals. the (lack of) air up there watch mcayman islands-based webb, the head of fifas anti-racism taskforce, is in london for the football associations 150th anniversary celebrations and will attend citys premier league match at chelsea on sunday. “i am going to be at the match tomorrow and i have asked to meet yaya toure,“ he told bbc sport. “for me its about how he felt and i would like to speak to him first to find out what his experience was.“ uefa has opened disciplinary proceedings against cska for the “racist behaviour of their fans“ during citys 2-1 win. michel platini, president of european footballs governing body, has also ordered an immediate investigation into the referees actions. cska said they were “surprised and disappointed“ by toures complaint. in a statement the russian side added: “we found no racist insults from fans of cska.“ age has reached the end of the beginning of a word. may be guilty in his seems to passing a lot of different life became the appearance of the same day; may be back in the past, to oneself the paranoid weird belief disillusionment, these days, my mind has been very messy, in my mind constantly. always feel oneself should go to do something, or write something. twenty years of life trajectory deeply shallow, suddenly feel something, do it. 一字開頭的年齡已經(jīng)到了尾聲?；蛟S是愧疚于自己似乎把轉(zhuǎn)瞬即逝的很多個(gè)不同的日 子過成了同一天的樣子；或許是追溯過去，對自己那些近乎偏執(zhí)的怪異信念的醒悟，這些 天以來，思緒一直很凌亂，在腦海中不斷糾纏?？傆X得自己自己似乎應(yīng)該去做點(diǎn)什么，或 者寫點(diǎn)什么。二十年的人生軌跡深深淺淺，突然就感覺到有些事情，非做不可了。 the end of our life, and can meet many things really do? 而窮盡我們的一生，又能遇到多少事情是真正地非做不可？ during my childhood, think lucky money and new clothes are necessary for new year, but as the advance of the age, will be more and more found that those things are optional; junior high school, thought to have a crush on just means that the real growth, but over the past three years later, his writing of alumni in peace, suddenly found that isnt really grow up, it seems is not so important; then in high school, think dont want to give vent to 13 out your inner voice can be in the high school children of the feelings in a period, but was eventually infarction when graduation party in the throat, later again stood on the pitch he has sweat profusely, looked at his thrown a basketball hoops, suddenly found himself has already cant remember his appearance. 童年時(shí)，覺得壓歲錢和新衣服是過年必備，但是隨著年齡的推進(jìn)，會(huì)越來越發(fā)現(xiàn)，那 些東西根本就可有可無；初中時(shí)，以為要有一場暗戀才意味著真正的成長，但三年過去后， 自己心平氣和的寫同學(xué)錄的時(shí)候，突然就發(fā)現(xiàn)是不是真正的成長了，好像并沒有那么重要 了；然后到了高中，覺得非要吐露出自己的心聲才能為高中生涯里的懵懂情愫劃上一個(gè)句 點(diǎn)，但畢業(yè)晚會(huì)的時(shí)候最終還是被梗塞在了咽喉，后來再次站在他曾經(jīng)揮汗如雨的球場， 看著他投過籃球的球框時(shí)，突然間發(fā)現(xiàn)自己已經(jīng)想不起他的容顏。 originally, this world, can produce a chemical reaction to an event, in addition to resolutely, have to do, and time. 原來，這個(gè)世界上，對某個(gè)事件能產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)的，除了非做不可的堅(jiān)決，還有，時(shí) 間。 a persons time, your ideas are always special to clear. want, want, line is clear, as if nothing could shake his. also once seemed to be determined to do something, but more often is he backed out at last. dislike his cowardice, finally found that there are a lot of love, there are a lot of miss, like shadow really have been doomed. those who do, just green years oneself give oneself an arm injection, or is a self-righteous spiritual. 一個(gè)人的時(shí)候，自己的想法總是特別地清晰。想要的，不想要的，界限明確，好像沒 有什么可以撼動(dòng)自己。也曾經(jīng)好像已經(jīng)下定了決心去做某件事，但更多的時(shí)候是最后又打 起了退堂鼓。嫌惡過自己的怯懦，最終卻發(fā)現(xiàn)有很多緣分，有很多錯(cuò)過，好像冥冥之中真 的已經(jīng)注定。那些曾經(jīng)所謂的非做不可，只是青蔥年華里自己給自己注射的一支強(qiáng)心劑， 或者說，是自以為是的精神寄托罷了。 at the moment, the sky is dark, the air is fresh factor after just rained. suddenly thought of blue plaid shirt; those were broken into various shapes of stationery; from the corner at the beginning of deep friendship; have declared the end of the encounter that havent start planning. those years, those days of do, finally, like youth, will end in our life. 此刻，天空是陰暗的，空氣里有著剛下過雨之后的清新因子。突然想到那件藍(lán)格子襯 衫；那些被折成各種各樣形狀的信紙；那段從街角深巷伊始的友誼；還有那場還沒有開始 就宣告了終結(jié)的邂逅計(jì)劃那些年那些天的非做不可，終于和青春一樣，都將在我們的 人生中謝幕。 baumgartner the disappointing news: mission aborted. r plays an important role in this mission. starting at the ground, conditions have to be very calm - winds less than 2 mph, with no precipitation or humidity and limited cloud cover. the balloon, with capsule attached, will move through the lower level of the atmosphere (the troposphere) where our day-to-day weather lives. it will climb higher than the tip of mount everest (5.5 miles/8.85 kilometers), drifting even higher than the cruising altitude of commercial airliners (5.6 miles/9.17