人教版教學(xué)課件DNA的粗提取與鑒定(阜陽(yáng)市太和縣第二中學(xué) 高金玲).ppt

選修I 專(zhuān)題5 課題1 DNA的粗提取與鑒定 阜陽(yáng)市 太和縣第二中學(xué) 高金玲,討論2：如何證明他們是遺傳物質(zhì)？,討論3：怎樣才能將細(xì)胞內(nèi)的這些物質(zhì)分離出來(lái)？,一、知識(shí)回顧 討論1：構(gòu)成生物體的遺傳物質(zhì)是什么？,二、基礎(chǔ)知識(shí),提取DNA的方法,1、提取生物大分子的基本思路,選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子,2、生物大分子,主要指蛋白質(zhì)、酶和核酸,3、提取DNA的基本思路,利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分,4、DNA的溶解性,DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反,5、討論：,根據(jù)DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線圖，思考在什么濃度下， DNA的溶解度最??？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何變化的？,在NaCl溶液濃度低于0.14 mol/L時(shí)，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低；在0.14 mol/L時(shí)，DNA溶解度最??；當(dāng)NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時(shí)，DNA的溶解度又逐漸增大。,當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為 2 molL時(shí)，DNA的溶解度最大，濃度為 014 molL時(shí)，DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使DNA在鹽溶液中溶解或析出,如何通過(guò)控制NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出？,DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離,6、DNA在酒精溶液中的溶解性,7、DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性,蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對(duì)DNA沒(méi)有影響,大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受6080C的高溫，而DNA在80C以上才會(huì)變性,洗滌劑可以溶解細(xì)胞的細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì),但對(duì)DNA沒(méi)有影響,8、DNA的鑒定, DNA與二苯胺（沸水?。?huì)染成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑,紫外燈照射法,A、配制染色劑，用蒸餾水配制萬(wàn)分之五的溴化已錠（EB）,B、將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹于蠟紙上，再滴一滴EB溶液染色,C、將蠟紙放在紫外燈(260 nm)下照射（暗室中），可見(jiàn)橙紅色的熒光(DNA的紫外吸收高峰在260 nm處),甲基綠 （藍(lán)綠色）,三、DNA的粗提取與鑒定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),（一）實(shí)驗(yàn)材料的選取,1、材料：魚(yú)卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌。（從中選取23種實(shí)驗(yàn)材料）,2、原則：凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但選用DNA含量相對(duì)較高的生物組織，成功的可能性更大,動(dòng)物細(xì)胞的破碎較易，例如，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水 ，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過(guò)濾后收集濾液即可,（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液,1、動(dòng)物細(xì)胞,答：蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA,討論：為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？,植物細(xì)胞需要先用一定的洗滌劑和食鹽溶解細(xì)胞膜,2、植物細(xì)胞,討論：加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？,答：洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解,實(shí)例：提取洋蔥DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行從分的攪拌和研磨，過(guò)濾后收集研磨液,答：研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等,討論：如果研磨不充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？,（三）去除濾液中的雜質(zhì),為了純化提取的DNA需要將濾液作進(jìn)一步處理,討論：此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？,答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì),討論：為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì),答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過(guò)反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì),討論：方案二與方案三的原理有什么不同？,答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開(kāi)；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離,（四） DNA的析出與鑒定,DNA的析出用的是與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為95 ） ，靜置23min，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水,1、DNA的析出,2、 DNA的鑒定,鑒定DNA時(shí)在試管中先加入物質(zhì)的量的濃度為2mol/L 的NaCl溶液5ml于兩只試管中，其中一只加入DNA絲狀物，各加入二苯胺4ml 試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱5min,待試管冷卻后，比較兩只試管中溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否有藍(lán)色,（一）案例一：以雞血為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取,四、實(shí)驗(yàn)案例,雞血細(xì)胞極易吸水脹破，而用動(dòng)物肝臟細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料常常需要?jiǎng)驖{和離心，對(duì)設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時(shí)較長(zhǎng),1、雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料的原因,雞血細(xì)胞核的DNA含量豐富，材料易得,2、實(shí)驗(yàn)原理, DNA在NaCl溶液中的溶解度，是隨著NaCl的濃度的變化而改變的。當(dāng)NaCl的物質(zhì)的量濃度為0.14 molL時(shí),DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。, DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)可以溶于酒精溶液。利用這一原理，可以進(jìn)一步提取出含雜質(zhì)較少的DNA。, DNA遇二苯胺（沸水?。?huì)染成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。,3、實(shí)驗(yàn)材料和用具：,雞血細(xì)胞液（510ml）；體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精溶液（實(shí)驗(yàn)前置于冰箱內(nèi)冷卻24h）；蒸餾水；質(zhì)量濃度為0g/ml的檸檬酸納溶液；務(wù)質(zhì)量的濃度分別為2mol/L和0015mol/L的氯化納溶液；二苯胺試劑。鐵架臺(tái)；鐵環(huán)；鑷子；三角架；酒精燈；石棉網(wǎng)；載玻片；玻璃棒；濾紙；滴管；量筒（100ml，一個(gè)）；燒杯；（100ml，一個(gè)，50ml、500ml各二個(gè)）；試管（20ml，二個(gè)）；漏斗；試管夾；紗布。,4、課前準(zhǔn)備雞血細(xì)胞液,取質(zhì)量濃度為01g/ml的檸檬酸納溶液（抗凝劑）100ml，置于500ml燒杯中。注入新鮮的雞血（約180ml），同時(shí)用玻璃棒攪拌，使血液與檸檬酸納溶液充分混合，以免凝血。將燒杯中的血液置于冰箱內(nèi)，精置一天，使血細(xì)胞自行沉淀。（也可以將血液倒入離心管內(nèi)，用1000r/min（轉(zhuǎn)每分）的離心機(jī)離心2min，血細(xì)胞沉淀于離心管底部。實(shí)驗(yàn)時(shí)。用吸管除去離心管上部的澄清液，就可以得到雞血細(xì)胞液。）,過(guò)程,檸檬酸鈉作用,防止血液凝固,作用機(jī)理,檸檬酸鈉能與血漿中的Ca2+發(fā)生反應(yīng)，生成檸檬酸鈣絡(luò)合物，血漿中游離的Ca2+大大減少，血液就不會(huì)凝固,雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取過(guò)程中為了減少DNA的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細(xì)胞液,注意事項(xiàng),討論：提取雞血中的DNA時(shí)，為什么除去血液中的上清液？,答：血液分為兩部分，一部分是血漿，一部分是血細(xì)胞，離心后除去的上清液是血漿,5、方法步驟,將制備好的雞血細(xì)胞液5 mL10mL，注入到50 mL燒杯中。向燒杯中加入蒸餾水20 mL，同時(shí)用玻璃棒充分?jǐn)嚢? min，使血細(xì)胞加速破裂。然后，用放有紗布的漏斗將血細(xì)胞液過(guò)濾至500mL。取其濾液。,提取雞血細(xì)胞的細(xì)胞核物質(zhì),討論：,答：讓細(xì)胞內(nèi)濃度大于周?chē)芤旱臐舛龋?xì)胞會(huì)吸水以至脹破,（1）為什么要加入蒸餾水？加入蒸餾水后細(xì)胞會(huì)有什么變化？,（2）用玻璃棒攪拌有什么意義？,答：用玻璃棒攪拌可以加速血細(xì)胞和細(xì)胞核的破裂。注意應(yīng)沿一個(gè)方向快速攪拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA,（3）濾去的是什么物質(zhì)？得到的是什么？,答：過(guò)濾將濾去的是細(xì)胞膜和核膜等物質(zhì)；得到的是與蛋白質(zhì)等物質(zhì)結(jié)合在一起的DNA,溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA,將氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為 2 mol的溶40mL加入到濾液中，并用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌1min，使其混合均勻，這時(shí)DNA在溶液中呈溶解狀態(tài),沿?zé)瓋?nèi)壁緩緩加入蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒不停地輕輕攪拌，這時(shí)燒杯中有絲狀物出現(xiàn)，注意觀察絲狀物呈什么顏色。繼續(xù)加入蒸餾水，溶液中出現(xiàn)的粘稠物會(huì)越來(lái)越多。當(dāng)粘稠物不再增加時(shí)停止加入蒸餾水（這時(shí)溶液中氯化鈉的物質(zhì)的量濃度相當(dāng)于0.14 molL）,析出含DNA的粘稠物,討論：加入蒸餾水的目的？,降低NaCl溶液濃度到使DNA溶解度最低點(diǎn)，使DNA從NaCl溶液中析出,將溶液中的DNA與其他雜質(zhì)分離，這一步驟是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該緩慢貼壁加入蒸餾水，并輕輕地沿一個(gè)方向不停地均勻攪拌，以利于DNA分子的附著和纏繞,注意事項(xiàng)：,濾取含DNA的粘稠物,用放有多層紗布的漏斗，過(guò)濾步驟3中的溶液至 500mL的燒杯中，含 DNA的粘稠物被留在紗布上,將DNA的粘稠物再溶解,取 1個(gè) 50 mL燒杯，向燒杯內(nèi)注入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為 2 molL的溶液 20mL。用鈍頭鑷子將紗布上的粘稠物夾至氯化鈉溶液中，用玻璃擇不停地?cái)嚢?，使粘稠物盡可能多地溶解于溶液中,過(guò)濾含有DNA的氯化鈉溶液,取1個(gè)100 mL燒杯，用放有兩層紗布的漏斗過(guò)濾步驟5中的溶液。取其濾液，DNA溶于濾液中,提取含雜質(zhì)較少的DNA,在上述濾過(guò)的溶液中，加入冷卻的、酒精的體積分?jǐn)?shù)為 95的溶液 50mL（使用冷卻的酒精，對(duì)DNA的凝集效果較佳），并用玻璃棒攪拌，溶液中會(huì)出現(xiàn)含雜質(zhì)較少的絲狀物。用玻璃棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。這種絲狀物的主要成分就是DNA,答：因?yàn)镈NA不溶于冷酒精，而其他物質(zhì)可以溶解在酒精中，使含雜質(zhì)較少的DNA絲狀物可以析出,懸浮于溶液中,討論：,（2）觀察絲狀物呈什么顏色？,答：白色,（1）為什么要加50mL的冷酒精？,取兩支20 mL的試管，各加入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為0015 molL的溶液5 mL，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4mlL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱 5 min，待試管冷卻后，觀察并且比較兩支試管中溶液顏色的變化, DNA的鑒定,討論：,答：有絲狀物的試管變成藍(lán)色，另一試管還是原來(lái)顏色,（2）這一鑒定結(jié)果說(shuō)明什么問(wèn)題？,（1）比較兩個(gè)試管中溶液的顏色有什么不同？,答：提取出的絲狀物是DNA,（3） DNA的直徑約為2010-10 m，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的絲狀物的粗細(xì)是否表示1個(gè)DNA分子直徑的大?。?答： DNA分子直徑只有2 nm。絲狀物是多個(gè)DNA子聚在一起形成的,答：整個(gè)實(shí)驗(yàn)共“兩次蒸餾水，三次過(guò)濾，兩次析出，六次攪拌”,6、討論：,兩次蒸餾水,第一次：細(xì)胞吸水脹破 第一步 第二次：使 DNA黏稠物析出 第三步,（1）此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有幾次使用蒸餾水？幾次過(guò)濾，幾次析出，幾次攪拌？分別在哪一步？,過(guò)濾時(shí)使用的紗布層數(shù)與需用濾液或黏稠物有關(guān)，第二次要用其濾出的黏稠物有關(guān)，所以要使用多層紗布，第一次和第三次均要用其濾液，使用的紗布為12層,三次過(guò)濾,第一次： DNA存在于濾液里 第一步 第二次： DNA被留在紗布上 第四步第三次： DNA存在于濾液里 第六步,兩次析出,第一次：用0.14 molL 的NaCI溶液含雜質(zhì)多,第三步,第二次：用冷卻的95的酒精,第七步,六次攪拌：第一、二、三、五、七步,其中除第八步外，其余均要朝一個(gè)方向攪拌，在第三、五步攪動(dòng)還要輕緩，玻璃棒不要直插燒杯底部，這樣才能保證得到完整的DNA,（2）為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？,答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過(guò)反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì),（二）案例二：以菜花為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取,1、課前準(zhǔn)備,將新鮮菜花和體積分?jǐn)?shù)為95的乙醇溶液放入冰箱冷凍室24 h,2、提取DNA的具體步驟,取材：稱(chēng)取30 g菜花，去梗取花，切碎,研磨：將碎菜花放入研缽中，倒入10 mL研磨液，充分研磨10 min,過(guò)濾：在漏斗中墊上尼龍紗布，將菜花研磨液過(guò)濾到燒杯中(有條件的學(xué)校可將濾液倒入塑料離心管中進(jìn)行離心，用1000 r/min的轉(zhuǎn)速，離心25 min，取上清液放入燒杯中)。在4 冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液,沉淀：將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95的預(yù)冷乙醇溶液中，并用玻璃棒緩緩、輕輕地?cái)嚢枞芤?玻璃棒不要直插到燒杯底部)。沉淀35 min后，可見(jiàn)白色的DNA絮狀物出現(xiàn)。用玻璃棒緩緩旋轉(zhuǎn)，將絮狀物纏繞在玻璃棒上,觀察