第三節(jié)免疫檢測技術(shù)的基本原理ppt課件

第三節(jié)免疫檢測技術(shù)的基本原理 抗原 抗體反應(yīng)的原理 利用已知的抗原檢測未知的抗體或利用已知的抗體檢測未知的抗原 將免疫反應(yīng)與現(xiàn)代測試技術(shù)結(jié)合超微量的檢測 免疫學(xué)檢測技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) 高度的靈敏性高度的特異性 免疫分析技術(shù)的應(yīng)用 常用的診斷技術(shù)血凝試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)?zāi)z體金免疫技術(shù)放射免疫分析技術(shù) 凝集試驗(yàn) 概念 顆粒性抗原 細(xì)菌 紅細(xì)胞等 與相應(yīng)抗體結(jié)合 在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的凝集物 稱為凝集反應(yīng) 1 直接凝集反應(yīng)抗原與抗體直接混合作用 出現(xiàn)凝集為陽性結(jié)果 玻片直接凝集法 定性試驗(yàn) 試管直接凝集法 半定量試驗(yàn) 試管法半定量試驗(yàn) 2 間接凝集法 先將可溶性抗原或抗體吸附在顆粒載體上 如RBC 乳膠顆粒 再與相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng) 出現(xiàn)凝集為陽性結(jié)果 臨床常用的有間接血凝試驗(yàn) 乳膠凝集試驗(yàn)等 待檢樣品 抗原吸附血球或乳膠顆粒 反應(yīng)凝集物 3 間接凝集抑制試驗(yàn) 先將待檢抗原與已知的抗體反應(yīng) 再加入用已知抗原吸附的載體顆粒 不出現(xiàn)凝集為陽性結(jié)果 例 乳膠凝集抑制試驗(yàn)檢測HCG 妊娠診斷 步驟1 將已知抗體與待檢標(biāo)本混勻 步驟2 加入抗原吸附的乳膠顆?；靹?抗原吸附乳膠顆粒 結(jié)果判斷 不凝集為陽性結(jié)果 已知抗體 待檢標(biāo)本 凝集反應(yīng) 2 沉淀反應(yīng) 概念 可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)沉淀物稱沉淀反應(yīng) 類型 單向免疫擴(kuò)散 免疫比濁法 雙向免疫擴(kuò)散 對(duì)流免疫電泳 單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 對(duì)流免疫電泳 測吸光度計(jì)算抗原或抗體的含量 抗體 抗原 免疫復(fù)合物的濃度與透射光的衰減呈正相關(guān) 免疫比濁法原理 3 中和反應(yīng)如抗 O 試驗(yàn) 4 免疫標(biāo)記技術(shù) 概念 用熒光素 酶 同位素等標(biāo)記抗體或抗原用以測定相應(yīng)抗原或抗體的技術(shù)稱為免疫標(biāo)記技術(shù) 常用方法有免疫熒光技術(shù) 酶免疫技術(shù) 放射免疫檢測技術(shù)等 特點(diǎn) 敏感 特異 快速 能定性 定量 定位 免疫標(biāo)記技術(shù) 酶免疫標(biāo)記技術(shù)熒光免疫分析技術(shù)放射免疫分析技術(shù)免疫金標(biāo)記技術(shù) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann 荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法 即酶聯(lián)免疫吸附測定法 enzyme linkedimmunosorbentassay ELISA 酶及其底物酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原 半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物 是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑 它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng) 還具有酶促反應(yīng) 顯示出生物放大作用 但不同的酶選用不同的底物 將得到不同的顏色反應(yīng) 2 標(biāo)記方法戊二醛交聯(lián)法過碘酸鹽氧化法 戊二醛交聯(lián)法 一步法 抗體 NH2 COH CH2 3 COH NH2 酶 抗體 NH2 CH CH2 3 CH NH2 酶 抗體 NH2 CH CH2 3 CH NH2 抗體 酶 NH2 CH CH2 3 CH NH2 酶 戊二醛交聯(lián)法 二步法 COH CH2 3 COH NH2 酶 抗體 NH2 CHO CH2 3 CH NH2 酶 抗體 NH2 CH CH2 3 CH NH2 酶 過碘酸鹽氧化法 NaIO4 O O OH NH2抗體 O O O N N 抗體 抗體 H2O N 抗體 NaBH4 Schiff堿 酶 五炭糖環(huán) 標(biāo)記免疫物的分離與鑒定 1 分離目的 去除游離酶方法 鹽析 柱層析2 鑒定抗體活性酶活性標(biāo)記物純度 ELISA的種類和變化 一 雙抗體夾心法 二 間接法 三 競爭法 四 雙位點(diǎn)一步法 五 捕獲法測IgM抗體 六 應(yīng)用親和素和生物素的ELISA 一 雙抗體夾心法 此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原 獲得待分析物的未標(biāo)定抗體 將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體 洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì) 加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點(diǎn) 洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白 加受檢標(biāo)本 抗原 形成固相抗體 抗原復(fù)合物 洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì) 加酶標(biāo)抗體生成抗體 待測抗原 酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物 徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體 加底物進(jìn)行酶催化反應(yīng) 根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測定 間接法是檢測抗體最常用的方法 其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體 故稱為間接法 二 間接法 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ELISA 間接法 包被固相載體 用已知抗原包被固相載體 加待檢標(biāo)本 使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合洗滌 除去無關(guān)的物質(zhì) 加酶標(biāo)抗抗體 與固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合 洗滌 除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體 加底物顯色 根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測定 三 競爭法 此法可用于抗原和半抗原的定量測定 也可用于測定抗體 用已知特異性抗體包被固相載體 測定管加待測抗原和一定量的酶標(biāo)抗原使二者與固相抗體競爭結(jié)合 對(duì)照管只加一定量酶標(biāo)抗原與固相抗體直接結(jié)合 分別洗滌除去未結(jié)合的成分 加底物顯色 分別測定兩管的吸光度值 根據(jù)對(duì)照管與測定管吸光度值之比 計(jì)算標(biāo)本中待測抗原含量 對(duì)照管由于只加酶標(biāo)抗原 與固相抗體充分結(jié)合 故分解底物顯色深 測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競爭結(jié)合的結(jié)果而異 如待測抗原量多 競爭性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合 使固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少 因此 加入底物后顯色反應(yīng)較弱 飼料中鹽酸克倫特羅的測定飼料中毒素的測定 主要包括黃曲霉毒素 簡曲霉毒素 飼料中有害微生物的快速篩檢 如沙門氏菌 甲胺磷殘留分析甲基對(duì)硫磷殘留分析呋喃丹殘留分析 ELISA在飼料安全檢測中的應(yīng)用 ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測 河豚毒素 植物毒素如罌粟鹼 嗎啡 藻類毒素 苯并芘 主要有除草劑與殺蟲劑兩大類例如殺暝松 FN 甲氟磷酸異已酶 SOMAN 草不綠 Alachor 西維因 Carbaryl 多菌靈及克菌丹 Captan 等 農(nóng)藥的檢測 食源性病原菌檢測試劑盒 大腸桿菌檢測沙門氏菌檢測單增李斯特菌金黃色葡萄球菌 轉(zhuǎn)基因成份的檢測 如轉(zhuǎn)基因玉米中中的cry9e蛋白轉(zhuǎn)基因大豆中的CP4EPSPS蛋白質(zhì) 肉制品的摻假檢測 以辣根過氧化物酶標(biāo)記不同動(dòng)物肌肉和血清球蛋A抗血清檢查牛肉 馬肉 豬肉 羊肉和駝肉檢測14種畜禽熟肉制品 包括牛肉 羊肉 鹿肉和馬肉等 在摻假率為1 時(shí)即可檢出 食品其他檢測 熒光抗體技術(shù)的原理與方法 用熒光素標(biāo)記抗原或抗體 再與標(biāo)本中抗體或抗原反應(yīng) 然后在熒光顯微鏡下觀察 形成的IC可散發(fā)出熒光 對(duì)標(biāo)本中的抗原或抗體進(jìn)行測定和定位 常用的熒光素異硫氰酸熒光素 FITC 藻紅蛋白 PE 等 常用的方法直接熒光法間接熒光法 免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù) 直接法 免疫熒光技術(shù) 間接法 免疫熒光技術(shù) 熒光顯微鏡 熒光顯微鏡使用原理 激發(fā)濾片 BG 吸收濾片 OG 標(biāo)本 FITC吸收光峰值 490 495nmFITC發(fā)射光峰值 520 530nmBG 325 500OG 410 650 免疫金標(biāo)記技術(shù) 免疫金標(biāo)記技術(shù) Immunogoldlabellingtechique 主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性 在金標(biāo)蛋白結(jié)合處 在顯微鏡下可見黑褐色顆粒 當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí) 肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn) 因而用于定性或半定量的快速免疫檢測 這一反應(yīng)也可以通過銀顆粒的沉積被放大 稱之為免疫金銀染色 immunogoldsilverstaining IGSS 一 膠體金制備 膠體金 colloidalgold 的制備一般采用還原法 常用的還原劑有檸檬酸鈉 鞣酸 抗壞血酸 白磷 硼氫化鈉等 向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子還原成金原子 形成金顆粒懸液 也稱金溶膠 goldsolution 膠體金的制備及特性 還原100ml0 01 HAuCl4所需量 膠體金 ColloidalGold 15 60nm 優(yōu)質(zhì) 劣質(zhì) 膠體金結(jié)合物 Conjugate 一 免疫滲濾測定 IFA 斑點(diǎn)滲漏法 其原理與層析法相類同 中心圓點(diǎn)為一株單抗 邊上小點(diǎn)為抗鼠二抗 先將待測樣品滴在其中 若有抗原即被結(jié)合在中心圓點(diǎn) 洗去未結(jié)合抗原 再滴加金標(biāo)另一株單抗 若有抗原則形成金 Ab Ag 薄膜的紅色斑點(diǎn) 而邊上是金 Ab Ab2 薄膜的質(zhì)控點(diǎn) 是為金標(biāo)二步法 IFA 雙抗體夾心法測抗原 IFA 結(jié)果判斷 二 免疫層析測定 ICA 層析法 將金標(biāo)的一株單抗吸附于下端的玻璃纖維紙上 浸入尿液 此金標(biāo)單抗即被溶解 并隨尿液上行 若尿中有相應(yīng)抗原 既形成Ag Ab 金復(fù)合物 當(dāng)上行至中段醋酸纖維薄膜 即與下端的另一株單抗結(jié)合并被固定下來 顯示陽性結(jié)果 其上方還有一條抗鼠二抗 待紅色金標(biāo)單抗上行此處即被固定下來 作為金標(biāo)單抗質(zhì)控的提示 此種方法稱金標(biāo)一步法 兔抗鼠IgG 鼠抗HCG單抗 金標(biāo)鼠抗HCG單抗 尿液浸濕標(biāo)志線 手持端 斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn) 一 斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn) 二 尿樣 陽性 弱陽性 陰性 無效 質(zhì)控線 測試線 ICA 雙抗體夾心法測抗原 ICA 競爭法測抗原 免疫層析試驗(yàn)競爭法測小分子抗原原理圖 ICA竟?fàn)幏ńY(jié)果觀察 陰性 陽性 無效 ICA 間接法測抗體 ICA結(jié)果觀察 陽性 陰性 無效 IFA與ICA的比較 IFA穿流 FLOWTHROUGH ICA橫流 LATERALFLOW 1 羅立新 繆瓏 潘力 等 快速檢測產(chǎn)單核李斯特菌免疫膠體金層析法的研究 J 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志 2006 16 2 154 156 2 賴衛(wèi)華 熊勇華 陳高明 等 應(yīng)用膠體金試紙條快速檢測赭曲霉毒素A的研究 J 食品科學(xué) 2005 26 5 204 207 3 諶志強(qiáng) 段惠莉 王新為 等 大腸埃希菌O157 H7的膠體金免疫滲濾法檢測 J 中國公共衛(wèi)生 2005 21 4 705 706 4 謝昭聰 宋志強(qiáng) 呂敬章 等 應(yīng)用膠體金免疫層析法檢測水產(chǎn)品中霍亂弧菌的研究 J 中國國境衛(wèi)生檢疫雜志 2005 28 3 163 165 5 王中民 李君文 王新為 等 免疫金滲濾試驗(yàn)檢測食品中沙門氏菌的研究 J 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展 2001 29 4 45 47 6 劉永德 汪毅 陳禹雷 免疫金探針快速檢測禽流感病毒研究 J 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào) 農(nóng)業(yè)科學(xué)版 2005 23 3 321 324 斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn) A D C B 陰性 未懷孕 陽性 懷孕 加尿樣 除去濾器 加膠體金標(biāo)記抗體 加洗滌液 結(jié)果判定 免疫印跡法圖解 SDS裂解病毒 聚丙酰胺凝膠電泳 95684512KD 電轉(zhuǎn)印至NC膜上 置待測血清中 漂洗 加酶標(biāo)抗抗體 漂洗 加底物顯色 1204124KD 第四節(jié)放射性核素標(biāo)記技術(shù) 一 常用標(biāo)記方法二 標(biāo)記免疫物的分離與純化 R 放射性核素示蹤高靈敏不直接探測待測物 而探測待測物上的標(biāo)記信號(hào) 標(biāo)記物的放大效應(yīng) I 免疫學(xué)反應(yīng)高特異廢除以往沿用的無機(jī)或有機(jī)試劑 代之以抗體為結(jié)合劑 常用標(biāo)記方法 1 常用放射性核素2 125I的標(biāo)記方法直接法 氯胺T法 間接法 連接法 直接法 氯胺T法 Na125I4 C 125I 氯胺T 間接法 連接法 Na125I 氯胺T 125I NSHPP 間接法 連接法 CH2 OH H C C N 蛋白質(zhì) HOH NH2 蛋白質(zhì) 125I 125I 標(biāo)記免疫物的分離與鑒定 1 分離目的 去除游離放射性核素方法 柱層析2 鑒定游離放射性核素含量免疫活性比放射性 mCi mg 結(jié)合相 游離相 放射免疫分析法的原理與方法 液閃儀 計(jì)數(shù)器 化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫技術(shù) 直接化學(xué)發(fā)光酶促化學(xué)發(fā)光特點(diǎn)電化學(xué)發(fā)光特點(diǎn) 標(biāo)記免疫分析三方式與四環(huán)節(jié) 三個(gè)方式A 直接法B 間接法C 夾心法四環(huán)節(jié)為 1 抗體生產(chǎn)2 標(biāo)記試劑制備3 分析方式設(shè)計(jì)4 分析信號(hào)檢測 免疫測定分類 均相免疫測定HOMOGEN