第四章第一節(jié)植物細(xì)胞組織和器官超低溫保存.ppt

第四章園藝植物種質(zhì)資源離體保存與無性系變異篩選,第一節(jié)園藝植物種質(zhì)資源的離體保存種質(zhì)保存（germplasmconservation）是指利用天然或人工創(chuàng)造的適宜環(huán)境保存種質(zhì)資源，使個(gè)體中所含遺傳物質(zhì)保持其遺傳的完整性和較高的活力，并能通過繁殖將其遺傳性傳遞下去。,種質(zhì)資源保存,常規(guī)的種質(zhì)資源保存的方法,1965年Henshaw和Morel首次提出germplasmconservationinvitro；1982年國際植物遺傳資源委員會(huì)專門成立了離體保存咨詢委員會(huì)(advisecommitteeoninvitrostorage)。,種質(zhì)資源離體保存（germplasmconservationinvitro）：限制生長保存和超低溫保存,一、限制生長保存限制生長保存（restrictingconservation）是指改變培養(yǎng)物生長的外界環(huán)境條件，限制離體保存材料的生長速度，使細(xì)胞生長降至最小限度，但不死亡，從而達(dá)到延長繼代培養(yǎng)時(shí)間的目的。目前使用較多的限制細(xì)胞生長的措施有改變培養(yǎng)環(huán)境（如降低培養(yǎng)溫度、減少培養(yǎng)瓶內(nèi)氧氣含量、減少光照等）、提高培養(yǎng)基滲透壓、加入生長抑制劑、饑餓法、失水干燥保存等。,低溫保存低溫保存又稱微生長保存或最小生長法，是利用植物生命活動(dòng)隨著溫度的降低而減弱甚至幾乎完全停止的原理，將外植體在低溫條件下，結(jié)合其他不適合生長的環(huán)境條件，從而抑制或延緩離體培養(yǎng)物的生長和發(fā)育，延長壽命、達(dá)到種質(zhì)保存的目的。低溫保存種質(zhì)常用溫度范圍有3種：常溫（205）、常低溫（015）、低溫（-800）。低溫保存是種質(zhì)資源短期和中期保存常用的方法。主要適用再生植株、分生組織培養(yǎng)物的保存,2.干燥保存將愈傷組織或體細(xì)胞胚等培養(yǎng)物，適當(dāng)干燥失水，移入適宜的低溫下，可成功保存種質(zhì)。（1）預(yù)處理：將蔗糖濃度增至0.15mol/L或更高，預(yù)處理12-20d。（2）干燥：包括膠囊化處理（encapasulationtreatment）和脫水處理（desiccationtreatment）等方法。（3）儲(chǔ)藏：通常選用0以上低溫，或室溫儲(chǔ)藏。,3.生長抑制保存采用生長抑制劑或生長延緩劑延緩培養(yǎng)物的生長，延長保存時(shí)間。如采用3mg/L的ABA使草莓試管苗在251的常溫下保存12個(gè)月，存活率62.5%；延長5個(gè)月保存時(shí)間。在62保存15個(gè)月，存活率100%。常用生長延緩劑有ABA、多效唑（PP333）、矮壯素（CCC）和比久(B9)和生長抑制劑三碘苯甲酸（TIBA）、烯效唑（S-3307）和青鮮素（MH）等。,4.高滲透壓保存提高培養(yǎng)基滲透壓可以一直培養(yǎng)材料的生長。如在培養(yǎng)基中添加滲透化合物，如高濃度蔗糖、甘露醇、山梨醇等。蔗糖濃度由3%提高到10%左右，可明顯抑制培養(yǎng)物的生長。,二、超低溫保存超低溫保存是指在-80至-196甚至更低溫度下進(jìn)行生物材料的保存。在超低溫環(huán)境下，植物活細(xì)胞的代謝和生長幾乎完全停止，植物處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，但能保持正常的活性和形態(tài)發(fā)生能力，從而達(dá)到長期保存的目的，在適宜的條件下可迅速繁殖，再生出新的植株，并保持原來的遺傳特性。,保持細(xì)胞培養(yǎng)物的遺傳穩(wěn)定性；2.長期保存植物的種質(zhì)資源;長期保存農(nóng)作物的優(yōu)良品種及其育種親本材料的種質(zhì)；建立長期保存的莖尖分生組織種質(zhì)庫及無病毒的原種；5.保存實(shí)驗(yàn)材料，防止再培養(yǎng)中遺傳變異。,超低溫保存的作用及意義,（一）超低溫保存的原理,在低于-800C的超低溫條件下，有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。因此采取適當(dāng)?shù)姆椒▽⑸锊牧辖抵脸蜏兀纯墒股顒?dòng)固定在某一階段而不衰老死亡。當(dāng)以適當(dāng)?shù)姆椒▽龃娴纳锊牧匣謴?fù)至常溫時(shí)，其內(nèi)部的生化反應(yīng)可恢復(fù)正常。,冷凍保存是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-800C的超低溫條件），并在此溫度下對(duì)其長期保存的過程。而復(fù)蘇是以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過程。不論是微生物、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進(jìn)行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。,水在低于零度的條件下會(huì)結(jié)冰。如果將細(xì)胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)結(jié)冰，所形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞而引起細(xì)胞死亡。這種因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷。,如果將細(xì)胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細(xì)胞外部的水分會(huì)首先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高。如果將細(xì)胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時(shí)間過長，細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子會(huì)受到損壞，細(xì)胞便發(fā)生滲漏，在復(fù)溫時(shí)，大量水分會(huì)因此進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞死亡。這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷。,當(dāng)溫度進(jìn)一步下降，細(xì)胞內(nèi)外都結(jié)冰，產(chǎn)生冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護(hù)劑，則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑容易同溶液中的水分子結(jié)合，從而降低冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷，細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。,在復(fù)蘇時(shí)，一般以很快的速度升溫，1-2分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫，細(xì)胞內(nèi)外不會(huì)重新形成較大的冰晶，也不會(huì)暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過長的時(shí)間，從而無冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的冷凍保護(hù)效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)。而且不同的冷凍保護(hù)劑其冷凍保護(hù)效果也不一樣。,1.主要儀器設(shè)備(1)用于組織和細(xì)胞培養(yǎng)的全套設(shè)備；(2)普通冰箱；(3)-70-80的超低溫冰箱；(4)程序降溫儀；,（二）超低溫保存的基本設(shè)備和程序,(5)玻璃或塑料試管（5ml或10m1），封蓋嚴(yán)密，不進(jìn)液氮；(6)液氮;(7)光學(xué)顯微鏡和紫外熒光顯微鏡；(8)分光光度計(jì)。,2.基本程序(1)材料的準(zhǔn)備與選擇。(2)預(yù)處理。(3)將材料裝入試管，并隨即插入冰浴中。(4)加入0預(yù)冷的冰保護(hù)劑，在0(冰浴中)放置30一45分鐘。(5)降溫冰凍。,(6)保存后的化凍：一般在3740溫水浴中快速化凍。(7)活力測(cè)定,通常采用TTC法(氯化三苯四氮唑還原法)。如果是單細(xì)胞或原生質(zhì)體，可采用活性熒光素染色法，顯示活細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)存活率。(8)再培養(yǎng)，觀察組織細(xì)胞恢復(fù)生長的速度、存活率、植株的再生能力。(9)遺傳性狀的分析：如植株的形態(tài)特征、生長發(fā)育狀況、染色體、同工酶及抗逆性等。,1材料的特性；植物的種子、莖尖、花粉、胚狀體、愈傷組織、懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體等均可用于超低溫保存。但基因型、抗凍性、器官組織和細(xì)胞年齡、生理狀態(tài)影響存活率。具有豐富稠密、未液泡化的細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞壁薄，體積小，分裂相細(xì)胞比例高，細(xì)胞內(nèi)自由水含量低的細(xì)胞適宜超低溫保存。2預(yù)處理目的：A.增加細(xì)胞分裂和同步化；B.減少細(xì)胞內(nèi)自由水的含量；C.增強(qiáng)細(xì)胞的抗寒性。,（三）影響超低溫保存效果的主要因素,預(yù)處理方法：(1)繼代培養(yǎng):細(xì)胞、組織繼代培養(yǎng)中細(xì)胞分裂分化同步化的調(diào)控，增加指數(shù)生長期細(xì)胞。(2)預(yù)培養(yǎng):增加培養(yǎng)基中的糖濃度，提高滲透壓；或在預(yù)培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)抗寒力的物質(zhì)或冰凍保護(hù)劑，如脫落酸(ABA)，山梨糖醇、脯氨酸及二甲基亞砜(DMSO)等。(3)低溫鍛煉：如香石竹莖尖經(jīng)4低溫預(yù)處理14天，不僅提高了存活率而且分化率從30增加到60。,3冰凍保護(hù)劑迄今，已經(jīng)報(bào)道了多種類型的冰凍保護(hù)劑。分為滲透性和非滲透性冰凍保護(hù)劑。前者如二甲基亞砜(DMSO)、甘油、乙二醇、乙酰胺等，后者有蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮（PVP)等。但作為冰凍保護(hù)劑的物質(zhì)應(yīng)該具備以下特性：（1）易溶于水；（2）在適當(dāng)濃度下對(duì)細(xì)胞無毒；（3）化凍后容易從組織細(xì)胞中去除。,冷凍保護(hù)劑的作用：(1)降低冰點(diǎn)，促進(jìn)過冷卻和“玻璃態(tài)化”的形成；(2)提高溶液的粘滯性，阻止冰晶的生長，(3)DMSO可使膜物質(zhì)分子重新分布，增加細(xì)胞膜的透性，在溫度降低時(shí)，加速細(xì)胞內(nèi)的水流到細(xì)胞外結(jié)冰，防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰的傷害；(4)穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的大分子結(jié)構(gòu)，特別是膜結(jié)構(gòu)，阻止低溫傷害，非透性保護(hù)劑的主要作用在質(zhì)膜上。,4降溫冰凍方法(1)快速冰凍法：將材料從0，或者其他預(yù)處理溫度(如木本植物的冬芽在-3-10預(yù)處理20天)直接投入液氮。其降溫速度在每分鐘l000以上。適合高度脫水的材料，如種子、花粉、冬芽等。植物體內(nèi)的水分在降溫冰凍過程中，從-10到-140是冰晶形成和增長的危險(xiǎn)溫度區(qū)，在-140以下，冰晶不再增生。因此，快速冰凍法成功的關(guān)鍵在于，利用超速冷凍，使細(xì)胞內(nèi)的水分迅速通過冰晶生長的危險(xiǎn)溫度區(qū)，即細(xì)胞內(nèi)的水分還未來得及形成冰晶中心，就降到了-196的安全溫度，從而避免了細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰的危險(xiǎn)。,(2)慢速冰凍法：通常成熟的植物細(xì)胞都具有大的液泡，含有大量水分。對(duì)大多數(shù)植物材料說來，不適宜采用快速冰凍法，而需要在冰凍保護(hù)劑存在的條件下，采用慢速冰凍法。以每分鐘0.1-10的降溫速度(一般12分較好)。降到-70左右，隨即浸入液氮，或者以此種速度連續(xù)降到-196。在這種降溫速度下，可以使細(xì)胞內(nèi)的水分有充足的時(shí)間不斷流到細(xì)胞外結(jié)冰，從而使細(xì)胞內(nèi)的水分減少到最低限度，達(dá)到良好的脫水效應(yīng)，避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。該方法適用于成熟含有大液泡和含水量高的細(xì)胞。,(3)兩步冰凍法：這種方法是慢凍法和快凍法的結(jié)合，或者說，是一種改良的慢凍法。第一步是用慢速降溫法從0降到一定的預(yù)凍溫度，并停留一段時(shí)間，使細(xì)胞達(dá)到適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)性脫水；第二步，投入液氮中迅速冰凍。,(4)逐級(jí)冰凍法：此方法是制備不同等級(jí)溫度的冰浴，如-10，-15，-23，-35，或-40等。保存材料經(jīng)冰凍保護(hù)劑在0預(yù)處理后，逐步通過這些溫度，樣品在每級(jí)溫度上停留一定時(shí)間(46分鐘)，然后浸入液氮。,5.冷凍保存：超低溫保存的冷源有干冰（-79）、超低溫冰箱（-80-150），液氮蒸汽相（-140）和液氮（-196）等，以液氮最為常用。,6解凍方法實(shí)驗(yàn)證據(jù)證實(shí)，植物的凍害常發(fā)生在冰涼和化凍兩個(gè)過程。因此要使植物種質(zhì)的超低溫保存獲得成功，不僅要求有一個(gè)合適的降溫冰凍程序，而且還要求采取合適的解凍方法，以避免在解凍過程中產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)的次生結(jié)冰，并應(yīng)防止在解凍吸水過程中水的滲透沖擊對(duì)細(xì)胞膜體系的破壞。,通常采用快速解凍方法，即將液氮保存后的材料在37-40的溫水浴中化凍。因?yàn)槌蜏乇鶅霾牧匣瘍鰰r(shí)，再次結(jié)冰的危險(xiǎn)溫度區(qū)域大約是-50至-10。從理論上說，借助迅速的化凍速度通過此溫度區(qū)，從而避免細(xì)胞內(nèi)次生結(jié)冰。慢速解凍是將液氮中保存的材料先置于0低溫下解凍，再逐級(jí)升至室溫下進(jìn)行解凍慢速解凍可以使水分緩慢深入細(xì)胞，避免因強(qiáng)烈滲透而造成水分對(duì)細(xì)胞膜的破壞，適合含水量較少的材料，如木本植物的冬芽。,7再培養(yǎng)：指已解凍的材料重新置于培養(yǎng)基上使其恢復(fù)生長的過程。再培養(yǎng)是檢驗(yàn)冷凍保存效果或確定保存方法是否適合的最根本方法。黑暗條件下有利于超低溫保存培養(yǎng)物的恢復(fù)生長。,顯示細(xì)跑活力的TTC法(氯化三苯四氮唑還原法)，反映脫氫酶活力。2顯示細(xì)胞存活率的二醋酸酯熒光素(FDA)染色法，反映酯酶的脫脂化作用，或采用中性紅染色法。3.再培養(yǎng)新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)。存在停滯期。,（四）超低溫保存后細(xì)胞活力、存活率及遺傳特性的觀測(cè),4.遺傳性狀的分析：1)細(xì)胞全能性的保持：形態(tài)發(fā)生能力的表達(dá)情況。2)后代的形態(tài)特征及生長發(fā)育狀況。3)后代染色體的分析。4)同工酶譜的分析。5)特殊產(chǎn)物的分析。6)抗逆性的分析。,芽及莖尖分生組織的超低溫保存,1、莖尖超低溫保存植物種類：,2.莖尖分生組織的超低溫保存程序（基于保護(hù)性脫水）：（1）種子消毒滅菌，種子經(jīng)70酒精迅速漂洗，10漂白粉溶液消毒20分鐘，無菌水洗滌4次(2)在無菌條件下播種于具潤濕濾紙的滅菌培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)。置于2528培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。(3)萌發(fā)生長45天后，在無菌條件下切取莖尖的分生組織，0.3一0.5mm長，第1對(duì)葉原基。在實(shí)體解副鏡下進(jìn)行操作。(4)將切取的莖尖分生組織接種于固體B5培養(yǎng)基上，內(nèi)含0.5pmolLBA及5%DMSO，光照16小時(shí)，溫度2015預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)。(5)預(yù)培養(yǎng)后，將培養(yǎng)瓶浸入冰浴中2小時(shí)。(6)將莖尖分生組織轉(zhuǎn)移到在冰浴中預(yù)冷的具有1m1液體B5培養(yǎng)基的離心管中。,(7)逐步加入等體積的預(yù)冷的10DMSO，在30分鐘內(nèi)加完，使DMSO的最終濃度為5%，然后再放置10一30分鐘(8)密封離心管口，以每分鐘降低0.6的速度慢速降溫到40，然后浸入液氮中(196)。(9)在液氮中貯存定時(shí)期后，取出材料在27水浴中迅速化凍?；瘍龊罅⒓磳⒃嚬苻D(zhuǎn)移到冰浴中(10)用等體積B5培養(yǎng)基在30分鐘內(nèi)，分6次逐步加入試管中。(11)吸去混合液，并用B5培養(yǎng)基洗滌4次。然后將莖尖分生組織轉(zhuǎn)移到固體B5分化培養(yǎng)基上。3周后可分化成苗。植株的再生率達(dá)70以上，已有的試驗(yàn)表明，貯存2年多仍能存活。,Sakai(1990)和Yamada(1991)建立了一種莖尖分生組織的超低溫保存簡(jiǎn)便方法，即玻璃化超低溫保存，該技術(shù)的關(guān)鍵是，在冰凍前，采用高濃度的冰凍保護(hù)劑使保存材料脫水，以致不需要慢速程序降溫，從室溫直接浸入液氯，即可獲得很高的存活率。玻璃化超低溫保存的優(yōu)點(diǎn)：（1）不需要昂貴的程序降溫儀；（2）避免細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成；（3）適合各種外植體。,基于玻璃化處理結(jié)合快速降溫的超低溫保存方法：（1）玻璃化法：是指冰凍保護(hù)劑對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理后，再用高濃度的玻璃化保護(hù)劑進(jìn)行脫水處理，然后快速投入液氮保存?；境绦颍翰牧线x擇-預(yù)處理-裝載-玻璃化保護(hù)劑脫水處理-液氮保存-解凍和洗滌-活性檢測(cè)和恢復(fù)培養(yǎng)。（2）包埋-脫水法：將包含樣品的海藻酸鈉溶液滴入高鈣溶液，固化成球狀顆粒，同時(shí)輔以高濃度蔗糖預(yù)處理樣品，使樣品獲得高抗凍力和抗脫水力。基本程序：材料選擇-海藻酸鈉包埋樣品-高濃度蔗糖預(yù)培養(yǎng)-無菌培養(yǎng)或硅膠中進(jìn)行干燥脫水-立即投入液氮-快速化凍-活性檢測(cè)。,（3）包埋-玻璃化法：綜合了璃化法和包埋脫水法的優(yōu)點(diǎn)而建立的方法。區(qū)別是在脫水處理時(shí)用玻璃化溶液代替干燥過程，然后使包埋珠和玻璃化溶液一同進(jìn)入玻璃化。易于操作，脫水時(shí)間短，能同時(shí)處理大量材料，存活率高。是莖尖分生組織保存的理想方法?；境绦颍翰牧线x擇-預(yù)處理-海藻酸鈣包埋-玻璃化溶液