凝膠層析分離混合蛋白實驗報告

1、竭誠為您提供優(yōu)質(zhì)文檔 /雙擊可除第 1 頁共 14 頁凝膠層析分離混合蛋白實驗報告篇一：凝膠過濾法分離蛋白質(zhì)實驗報告凝膠過濾法分離蛋白質(zhì)一、實驗?zāi)康牧私饽z層析的基本原理，并學(xué)會用凝膠層析分離純化 蛋白質(zhì)。二、實驗原理凝膠過濾其基本原理是利用被分離的分子大小不同及 固定相（凝膠）具有分子篩的特點：本實驗使用交聯(lián)葡聚凝 膠，其具有一定孔徑的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。高親水，在水溶液里吸水 可膨脹。當(dāng)其填充完成后，加入混合分子大小不同的分離液。由于大分子物質(zhì)只能沿著膠粒之間的間隙向下流動，所經(jīng)路 短，最先流出；而涌入膠粒內(nèi)部的小分子物質(zhì)，受迷宮效應(yīng) 的影響，要經(jīng)過層層擴散向下流動，所經(jīng)路程長，最后流出， 通透性居

2、中的分子則后于大分子而先于小分子流出。從而按 大到小的順序流出實現(xiàn)分離的目的。三、試劑與儀器O.1mol/L 磷酸緩沖液(ph7.0 ), 0.4%K3Fe(cn)6,交聯(lián)葡聚凝膠，雞的抗凝全血1.5*20cm 的層析柱，試管，量筒，大燒杯，玻璃棒四、實驗步驟1. 凝膠溶脹2. 裝柱：從層析柱加入緩沖液，打開出口，將氣泡趕走，關(guān)閉下端開口，然后加入約6cm 的緩沖液，灌注凝膠，打開下端開口。使其自然沉降高度約 17cm,并使其床面覆蓋緩沖 液，關(guān)閉出口蓋上小形圓形濾紙。待凝膠形成后，再用緩沖 液洗脫 23 次。3. 樣品處理4. 上樣和過濾：吸取約 0.5ml 混合液，在距離床面 1mm處沿管

3、內(nèi)壁輕輕加入樣品。打開出口，讓樣品溶液慢慢浸入 凝膠內(nèi)。凝膠柱面加上一層磷酸鹽緩沖液，并用12 倍體積的此緩沖洗脫。5. 部分收集：控制速度為 0.5ml/min 左右，用試管收集 洗脫液。并觀察柱上的色帶，待黃色篇二：生物化學(xué)實驗報告：蛋白質(zhì)分子量的測定凝 膠層析法實驗一蛋白質(zhì)分子量的測定一一凝膠層析法一、實驗?zāi)康?.掌握凝膠層析的基本原理。第 2 頁共 14 頁2.學(xué)習(xí)利用凝膠層析法測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的實 驗技能。二、實驗原理凝膠層析法也稱分子篩層析法，是利用具有一定孔徑大 小的多孔凝膠作固定相的層析技術(shù)。當(dāng)混合物隨流動相經(jīng)過 凝膠層析柱時，其中各組分按其分子大小不同而被分離的技 術(shù)。

4、該法設(shè)備簡單、操作方便、重復(fù)性好、樣品回收率高。 凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、呈珠狀 顆粒的物質(zhì)，每個顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)及篩孔的直徑均勻一致， 像篩子，小的分子可以進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，而大的分子則排阻于 顆粒之外。當(dāng)含有分子大小不一的蛋白質(zhì)混合物樣品加到用 此類凝膠顆粒裝填而成的層析柱上時，這些物質(zhì)即隨洗脫液 的流動而發(fā)生移動。大分子物質(zhì)沿凝膠顆粒間隙隨洗脫液移 動，流程短，移動速率快，先被洗出層析柱；而小分子物質(zhì) 可通過凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入顆粒內(nèi)部，然后再擴散出來，故流程長，移動速度慢，最后被洗出層析柱，從而使樣品中不同大小的 分子彼此獲得分離。若分子大小介于上述完全排阻或完全滲 入凝膠的物

5、質(zhì)，則居二者之間從柱中流出。總之，各種不同 相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)分子，最終由于它們被排阻和擴散的 程度不同，在凝膠柱中所經(jīng)過的路程和時間也不同，從而彼 此可以分離開來。將凝膠裝在柱后，柱床體積稱為“總體積”，以 Vt 表示。 實質(zhì)上 Vt 是由 Vo，Vi 與 Vg 三部分組成，Vo 稱為“孔隙體第 3 頁共 14 頁積”或“外水體積”，即存在于柱床內(nèi)凝膠顆粒外面空隙之 間的水相體積，相應(yīng)于一般層析法中柱內(nèi)流動相的體積；Vi為內(nèi)體積，即凝膠顆粒內(nèi)部所含水相的體積。Vg 為凝膠本身的體積。洗脫體積（Ve）與 Vo 與 Vi 之間的關(guān)系可用下式表 示：Ve=Vo+KdVi式中 Ve 為洗脫體積，自

6、加入樣品時算起，到組分最大 濃度（峰）出現(xiàn)時所流出的體積；Kd 為樣品組分在二相間的分配系數(shù)，也可以說 Kd 是分子量不同的溶質(zhì)在凝膠內(nèi)部與 外部的分配系數(shù)。它只與被分離的物質(zhì)分子的大小和凝膠顆 ?？紫兜拇笮》植加嘘P(guān)，而與柱的長度粗細(xì)無關(guān)，也就是說它對每一物質(zhì)為常數(shù)，與柱的物理條件無關(guān)。Kd 可通過實驗求得，上式可以改寫為：Kd=（Ve-Vo）/Vi上式中 Ve 為實際測得的洗脫體積；Vo 可用不被凝膠滯留的大分子物質(zhì)的溶液（最好是有顏色以便于觀察，如血紅 蛋白，印度黑墨水，分子量約 200 萬的藍(lán)色葡聚糖-2000 等） 通過實際測量求得；Vi 可由 gxwr 求得（g 為干膠重量，單 位為

7、克；wr 為凝膠的“吸水量”，以毫升每克表示）。因此， 對一層析柱膠床來說，只要通過實際實驗得知某一物質(zhì)的洗 脫體積就可算出它的 Kd 值。如果假定蛋白質(zhì)分子近于球形，同時沒有顯著的水合作用，貝 U 不同大小分子量的蛋白質(zhì)，在洗脫時峰的位置和該物第 4 頁共 14 頁質(zhì)相對分子質(zhì)量有直接的定量的關(guān)系。在一根凝膠柱中，凝 膠顆粒間空隙所含水相體積為外水體積Vo,不能進(jìn)入凝膠孔徑的那些大分子，當(dāng)洗脫體積為Vo 時，出現(xiàn)洗脫峰。凝膠顆粒內(nèi)部孔穴的總體積為內(nèi)水體積Vi，能全部滲入凝膠的那些小分子，當(dāng)洗脫體積為Vo+Vi 時，出現(xiàn)洗脫峰。Ve 與分子量的關(guān)系：對同一類型的化合物，洗脫特性與組分的分子量有

8、關(guān)，流過凝膠柱時，按分子量大小順序流出，分 子量大的走在前面。Ve 與分子量的關(guān)系可用下式表示：Ve=K1-K2logm,式中 m 為相對分子質(zhì)量，K1 和 K2 為常數(shù)，Ve 也可用 Ve-Vo。葡聚糖凝膠有不同的型號，用于分離不同相對分子質(zhì)量大小的物質(zhì)。例如 sephardexg-75 的分級范圍是 3000-80000 的球形分子。在本實驗中用于分離藍(lán)色葡聚糖和牛血清蛋白、胃蛋白酶、cytc。三、儀器和試劑1. 儀器：層析柱核酸蛋白檢測器（或紫外分光光度計）、自動部分收集器、刻度管。2. 試劑：藍(lán)色葡聚糖 2000、sephardexg-75、洗脫液：0.2mol/LTris-hcL-K

9、cL,ph7.5 。3. 待測樣品：藍(lán)色葡聚糖、牛血清蛋白、胃蛋白酶、cytc。四、實驗步驟1.凝膠溶脹凝膠顆粒要求大小比較均勻，可流速穩(wěn)定，結(jié)果較好。第 5 頁共 14 頁取葡聚糖 sephardexg-75 干粉，加過量的蒸餾水室溫充分溶 脹一天（溶脹時間因凝膠交聯(lián)度不同而不同），或沸水浴中溶脹 3 小時，這樣可大大縮短溶脹時間，而且可以殺死細(xì)菌 和霉菌，并可排出凝膠內(nèi)氣泡。溶脹過程中注意不要過分?jǐn)?拌，以防顆粒破碎。待溶脹平衡后用傾瀉法除去不易沉下的 細(xì)小顆粒，最后凝膠經(jīng)減壓抽氣除去氣泡，即可準(zhǔn)備裝柱。2. 裝柱與平衡裝柱前須將凝膠上面過多的溶液傾出，將層析柱垂直裝好。關(guān)閉出口，向柱管內(nèi)

10、加入約1/3 柱容積的洗脫液，然后在攪拌下，將濃漿狀的凝膠連續(xù)地傾入柱中，使之自然沉降，待凝膠沉降約 2 3cm 后，打開柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使凝膠繼續(xù)沉集，待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5cm 處時停止裝柱，關(guān)閉出水口。裝柱要求連續(xù)、均勻、無氣泡、 無“紋路”。將洗脫劑與恒流泵相連，恒流泵出口端與層析柱相連。通過 23 倍柱床容積的洗脫液使柱床平衡，然后在凝膠表 面上放一片濾紙或尼龍濾布，以防將來在加樣時凝膠被沖起， 并始終保持凝膠上端有一段液體。 3.調(diào)整洗脫速度上樣前應(yīng)調(diào)整洗脫速度，用自動收集器收集流出液，記錄每收集 2ml 液體所需時間，調(diào)整其速度在2min 左右。按上述時間設(shè)置

11、自動更換收集管。3 .上樣與洗脫樣品上柱是實驗成敗的關(guān)鍵之一，若樣品稀釋或上柱不第 6 頁共 14 頁均，會使區(qū)帶擴散，影響層析效果。上樣時應(yīng)盡量保持床面的穩(wěn)定。先打開柱的出口，待柱中洗脫液流至距床表面12mm 寸，關(guān)閉出口，用滴管將 1ml 樣品慢慢地加至柱床表面， 應(yīng)避免將床面凝膠沖起，打開出口并開始計算流出體積，當(dāng) 樣品滲入床中接近床表面 1mml時關(guān)閉出口。按加樣操作，用少量(約 1ml )洗脫液沖洗管壁 2 次。最后加入少量洗脫液 于凝膠上，使高出床表面35cm,旋緊上口螺絲帽，柱進(jìn)水口連通恒流泵，開始洗脫。上樣的體積，分析用量為柱床容積的 1 2%制備用量為柱床容積的20%30% 4.收集與鑒定每個收集管內(nèi)液體用紫外檢測儀在280nm 波長處檢測，出現(xiàn)最高的一個 oD 值時的體積即為吸收峰的洗脫體積 Ve。 5.凝膠柱的處理凝膠用過后，反復(fù)用蒸餾水洗后保存，如果有顏色或比較臟，可用 0.5