腺病毒載體構(gòu)建-文檔資料

1、1重組腺病毒的構(gòu)建2腺病毒 Adenovirus 最初由人類腺樣增殖體組織培養(yǎng)中分離得到的，此病毒名稱也由此而來(lái)。質(zhì)粒是直徑約70毫微米的正二十面體，各頂點(diǎn)具有突起。結(jié)構(gòu)亞基總數(shù)為252個(gè)。核酸是雙鏈DNA，分子量2025106。無(wú)包膜。在被感染的細(xì)胞核中增殖，病毒蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成，再輸送到細(xì)胞核。腺病毒可見于人、雞、牛、狗、鼠、豬和猴中，并各自具有嚴(yán)格的寄主特異性，不感染他種動(dòng)物。對(duì)人類可引起感冒癥狀、呼吸系統(tǒng)不適等。腺病毒腺病毒3腺病毒腺病毒 是一種大分子線性雙鏈無(wú)包膜DNA病毒。它通過(guò) 受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因

2、組中.4 ITR E1a/E1b E2 E3 E4 ITR腺病毒的基因及其功能腺病毒的基因及其功能 腺病毒基因組編碼數(shù)十個(gè)腺病毒的結(jié)構(gòu)和功能蛋白，分為早期表達(dá)和晚期表達(dá)。 早期表達(dá)的蛋白是功能蛋白，晚期表達(dá)的有功能蛋白也有結(jié)構(gòu)蛋白，并且早期的功能蛋白能夠調(diào)控晚期蛋白的表達(dá)。 早期表達(dá)的E1區(qū)蛋白（甚至包括E2區(qū)蛋白）是腺病毒基因組復(fù)制、病毒包裝和其他蛋白表達(dá)翻譯所必須的，但其對(duì)細(xì)胞毒性也是很強(qiáng)的。 E2蛋白涉及AdDNA復(fù)制 E3蛋白對(duì)抗宿主的抗病毒防御系統(tǒng) E4蛋白調(diào)節(jié)有效的晚期基因轉(zhuǎn)錄5第一代腺病毒載體：一般將E1或E3基因缺失的腺病毒載體成為一代 載體。此類型載體在未純化時(shí)可引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生

3、較 強(qiáng)的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，純化后可安全使用， 體內(nèi)表達(dá)周期可達(dá)4周。（科研、臨床應(yīng)用最廣泛科研、臨床應(yīng)用最廣泛 ，一般常用，一般常用Ad5Ad5型腺病毒型腺病毒）第二代腺病毒載體：一般將E2A或E4基因缺失的腺病毒載體成為二代 載體。產(chǎn)生的免疫反應(yīng)較弱，其安全性和載體容 量有所改進(jìn)，但病毒包裝難度和出毒滴度下降厲 害，應(yīng)用局限。第三代腺病毒載體：缺失了全部的（無(wú)病毒載體等）或大部分腺病毒 基因，僅保留ITR和包裝信號(hào)序列。這一載體系 統(tǒng)需要一個(gè)腺病毒突變體作為輔助病毒。6腺病毒載體大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）為基礎(chǔ)重組系統(tǒng)由2種質(zhì)粒構(gòu)成：一、包含全部（或右側(cè)大部分）腺病毒基因組DNA

4、的大質(zhì)粒，即骨架質(zhì)粒7二、小的穿梭質(zhì)粒，其帶有目的基因的表達(dá)盒以及表達(dá)盒兩側(cè)的與大質(zhì)粒上的目的基因擬插入部位同源序列（左右臂）89腺病毒粒子相對(duì)穩(wěn)定，插入外源基因的病毒基因組在腺病毒粒子相對(duì)穩(wěn)定，插入外源基因的病毒基因組在連續(xù)傳代中保持不變，易于用重組連續(xù)傳代中保持不變，易于用重組DNA技術(shù)操作。技術(shù)操作?？赊D(zhuǎn)入分裂后的非分裂細(xì)胞中發(fā)揮作用，可以感染處可轉(zhuǎn)入分裂后的非分裂細(xì)胞中發(fā)揮作用，可以感染處于分裂狀態(tài)的細(xì)胞。于分裂狀態(tài)的細(xì)胞?？山?jīng)不同途徑進(jìn)入不同組織可經(jīng)不同途徑進(jìn)入不同組織(可以在腸道內(nèi)繁殖，也可可以在腸道內(nèi)繁殖，也可以以 在呼吸道內(nèi)繁殖。在呼吸道內(nèi)繁殖。改建腺病毒基因部分缺失載體的克隆容量可達(dá)改建腺病毒基因部分缺失載體的克隆容量可達(dá)10kb，腺病毒基因完全缺失載體克隆容量可達(dá)腺病毒基因完全缺失載體克隆容量可達(dá)37kb。無(wú)需整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中，目的基因在宿主細(xì)胞無(wú)需整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中，