人胎盤與臍動、靜脈血造血干祖細胞歸巢相關(guān)黏附分子表達的研究

1、人胎盤與臍動、靜脈血造血干/祖細胞歸巢相關(guān)黏附分子表達的研究    作者：蘇蕊，陳代雄，方寧，陳琦，龔芳澤    【摘要】 為了評價人胎盤組織造血干/祖細胞（hematopoietic stem/progenitor cell，HSPC）的歸巢能力，采用機械法制備人胎盤組織單個細胞懸液，用流式細胞術(shù)分析胎盤組織及臍動、靜脈血有核細胞中CD34 細胞及其亞群的含量，檢測三者來源的CD34 細胞表面歸巢相關(guān)黏附分子CD44、CD11a、CD62L、CD49d、CD49e和CD54的表達水平。結(jié)果顯示，胎盤組織CD34

2、細胞及CD34 CD38-細胞百分率明顯高于臍動、靜脈血；臍動脈與臍靜脈血中HSPC百分率沒有明顯差異。胎盤來源CD34 細胞高度表達黏附分子CD11a、CD49d、CD44、CD49e及CD54，其中表達CD49e及CD54水平明顯高于臍動、靜脈血CD34 細胞。胎盤來源的CD34 CD62L 細胞百分率為(64.58±15.52)%，低于臍靜脈血來源的表達。結(jié)論：人胎盤富含HSPC。胎盤來源的CD34 細胞多數(shù)黏附分子的表達水平近似或高于臍血，提示胎盤HSPC的歸巢能力有可能強于臍帶血。    【關(guān)鍵詞】 胎盤 Expressions of

3、 Homing-Related Adhesion Molecules in Hemato-poietic Stem/Progenitor Cells Derived from Human Placenta，Umbilical Cord Arterial and Venous Blood Abstract The aim of this study was to evaluate the homing capabilities of hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) derived from human placenta tissues (P

4、T). Single cell suspension of human PT was prepared by mechanical method. The expression levels of homing-related adhesion molecules (HRAM) including CD11a，CD49d，CD44，CD49e，CD62L and CD54 on CD34 cells and the percentages of CD34 cells and their subpopulations in nucleated cells (NC) from fresh huma

5、n PT，umbilical cord arterial blood (UCAB) and umbilical cord venous blood(UCVB) were detected by using flow cytometry. The results showed that the percentage of CD34 cells and CD34 CD38- cells in placenta were higher than those in UCAB and UCVB. There were no significant difference in percentage of

6、HSPC between UCAB and UCVB. Placenta-derived CD34 cells strongly expressed CD11a，CD49d，CD44，CD49e and CD54，among which expression levels of CD49e and CD54 on placenta-derived CD34 cells were significantly higher than those on UCAB and UCVB-derived CD34 cells. While the percentage of CD34 CD62L cells

7、 in placenta was only lower than that in UCVB. It is concluded that human placenta is rich in HSPC. Moreover，the expression levels of most HRAM in CD34 cells from PT are higher than those from UCAB and UCVB or are close to them. It suggested that HSPCs derived from PT might have stronger homing capa

8、bilities than those from UCB. Key words placenta; umbilical cord artery; umbilical cord vein; hematopoietic stem/progenitor cell; adhesion molecule; homing    自發(fā)現(xiàn)臍帶血富含造血干/祖細胞（hematopoietic stem/progenitor cell，HSPC）以來，臍血HSPC的移植已成為治療骨髓造血功能衰竭、惡性血液病、重癥免疫缺陷、某些遺傳病等疾病的重要手段1-4。但是，單份臍血所含

9、的HSPC數(shù)量難以使一個成人獲得造血干細胞重建。因此，尋找富含HSPC的新資源是非常必要的，國內(nèi)已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)胎盤組織中含有比臍帶血更豐富的HSPC5。作為HSPC的成 功移植，除要有足夠數(shù)量的HSPC外，還要求HSPC能及時、高效地歸巢至骨髓造血微環(huán)境“龕”，這對HSPC的植活與造血重建具有決定意義6。HSPC表面黏附分子的正常表達是干細胞移植時HSPC實現(xiàn)歸巢及成功植入的關(guān)鍵。本研究中，我們利用了胎兒胎盤血循環(huán)的特點，即臍動脈血是由胎兒流到胎盤，而臍靜脈血則是由胎盤流回胎兒，分別測定臍動、靜脈血及胎盤組織中HSPC的含量及三者CD34 細胞表面黏附分子的表達，初步探討了胎盤HSPC的歸巢能力

10、，以期為人胎盤HSPC最終應(yīng)用于臨床移植提供有價值的實驗依據(jù)。 材料和方法 主要試劑 熒光標(biāo)記的CD分子系列單克隆抗體，anti-human CD34 Cy-chrome購自美國PharMingen公司。FITC標(biāo)記的CD38單克隆抗體、CD49d單克隆抗體和CD54單克隆抗體及PE標(biāo)記的CD11a單克隆抗體均購自晶美公司，PE標(biāo)記的CD62L及CD44單克隆抗體購自Biolegend公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD49e單克隆抗體購自SBA公司。IMDM培養(yǎng)液為Sigma公司產(chǎn)品。 胎盤和臍帶血標(biāo)本 經(jīng)知情同意后，無菌采集足月分娩胎兒的胎盤和臍動、靜脈血標(biāo)本6份，乙肝表面抗原（HBsAg）均為陰性。

11、新生兒娩出后，在距胎兒臍部最近端結(jié)扎兩處，從中間剪斷臍帶。胎盤殘存于子宮內(nèi)，并將距胎盤最近端臍帶夾閉以防止血液流出。碘伏充分消毒臍帶，用注射器分別穿刺臍動脈和臍靜脈，收集臍帶靜脈血及動脈血各約5 ml于收集管內(nèi)，同時收集胎盤。臍動、靜脈血分別用肝素抗凝（終濃度均為20 U/ml），4小時內(nèi)進行實驗。 胎盤細胞的制備 用Hanks液沖洗除去血塊，剪碎胎盤組織，并反復(fù)沖洗，盡量除去血液。將組織塊浸泡于IMDM培養(yǎng)液，采用搓網(wǎng)法分離細胞，收集細胞懸液，用320目尼龍網(wǎng)過濾，115×g離心3分鐘，收集細胞沉淀，懸浮于IMDM培養(yǎng)液中，臺盼藍染色示細胞活力>95%，調(diào)整細胞濃度為1

12、15;107/ml。 多色熒光染色 分臍動、靜脈血組和胎盤細胞懸液組，每組樣品100 l均分別與以下熒光標(biāo)記的CD分子抗體組合進行染色。用小鼠IgG作同型對照。 CD34PECy5 20 l，CD38FITC 10 l； CD34PECy5 20 l，CD49dFITC 10 l和CD11aPE 10 l； CD34PECy5 20 l，CD49eFITC 10 l和CD44PE 20 l； CD34PECy5 20 l，CD54FITC 10 l，CD62LPE 20 l。充分混勻，室溫避光靜置20分鐘。每管加入2 ml紅細胞裂解液，混勻，室溫靜置10分鐘，180×g離心5分鐘，棄

13、上清，重新懸浮細胞。每管加入2 ml含1 g/L NaN3的PBS，混勻，180×g 1%的多聚甲醛，混勻，2-8避光放置，逐一上機分析。 流式細胞儀檢測表面標(biāo)志    應(yīng)用流式細胞儀（FACS Calibur，Becton Dickinson）對熒光染色的胎盤細胞和臍動、靜脈血樣品進行HSPC含量及表面黏附分子表達檢測。樣品的采集和分析采用Cell Quest軟件，根據(jù)淋巴和單核細胞的大小設(shè)定CD34細胞門。 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.0軟件處理實驗數(shù)據(jù)，以x±SD表示。若方差齊性，則采用方差分析；若方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗

14、。 結(jié)果 CD34 細胞及其亞群的含量 實驗結(jié)果表明，臍動脈血和臍靜脈血之間HPSC含量無顯著性差別，胎盤組織和臍動脈、靜脈血中CD34 細胞百分率分別為（2.99±0.55）%、（1.46±0.39）%及（1.53±0.33）%，CD34 CD38-細胞百分率在胎盤組織為(1.40±0.53)%，顯著高于臍動脈、靜脈血（0.08±0.04，0.21±0.20)。這說明胎盤組織中含有比臍帶血更豐富的HSPC（表1）。Table 1. Comparison in proportional distribution of hematopo

15、ietic stem/progenitor cells in nucleated cells from placenta tissues，umbilical cord arterial and venous blood（略） 臍動脈、靜脈血和胎盤組織中CD34 細胞表達黏附分子的百分率從表2可以看出，CD11a、CD49d和CD44在臍動脈、靜脈血及胎盤組織來源的CD34 細胞中均呈現(xiàn)高表達率，但三者之間均無顯著性差異（P>0.05）。胎盤組織CD34 細胞表達CD49e和CD54分子百分率分別為(85.36±2.68)%和(72.44±11.58)%，顯著高于臍動脈

16、(27.18±11.00 )%和(22.89±13.58)%及臍靜脈血CD34 細胞表達(34.15±11.61) %和(28.39±13.38)%，三者之間均有非常顯著差異（P<0.001，附圖）。臍動脈、靜脈血和胎盤來源的CD34 細胞中CD62L表達率分別為(76.46± 9.88)%、(81.62±10.02)%和(64.58±15.52)%，與臍靜脈血相比，胎盤CD34 表達CD62L偏低（P<0.05，附圖）。 6種黏附分子在臍動脈、靜脈血CD34 細胞的表達率均無顯著差異（P>0.05）。Ta

17、ble 2. Expression of homing-related adhesion molecules on CD34 cells from placenta tissue，umbilical cord arterial and venous blood (略)    討論 自Takahashi7發(fā)現(xiàn)小鼠胎盤絨毛膜具有造血功能后，曾鳳華等8采用免疫組織化學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)妊娠6-42周的人胎盤絨毛膜間質(zhì)存在CD34 細胞。本研究結(jié)果顯示，在足月妊娠分娩胎兒的胎盤組織中，CD34 細胞及CD34 CD38-細胞含量均明顯高于臍動脈、靜脈血中的含量。據(jù)此我

18、們認為，胎盤組織中含有比臍血更豐富HSPC，而且是更為“早期”的CD34 CD38-造血干細胞。這似乎支持陳代雄等8早先提出的臍帶血HSPC來源于胎盤的觀點，人胎盤在胎兒發(fā)育期具有重要的造血功能。    本研究未發(fā)現(xiàn)臍動脈、靜脈血中HSPC含量的差別，這與曾鳳華等人的實驗結(jié)果不同。這可能與實驗方法和分析不同有關(guān)。目前普遍采用的方法是不分離單個核細胞（mononuclear cell，MNC），而用全血進行直接免疫熒光標(biāo)記9。本實驗采用直接對臍動脈、靜脈全血進行抗體標(biāo)記，進一步提高了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。另一方面，在進行流式細胞儀檢測時，為了使得到的數(shù)

19、據(jù)更為準(zhǔn)確，在分析結(jié)果時一般對目標(biāo)細胞都要設(shè)門（gate）。而曾鳳華等人在文獻中并沒有提到設(shè)CD34細胞門，這顯然會影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，值得提出的是，HSPC的遷移包括2個階段，即HSPC的歸巢和HSPC的遷出。為了尋求更適宜的造血微環(huán)境，骨髓中部分HSPC遷出骨髓。因此，臍靜脈和臍動脈血中HSPC含量沒有差別是極有可能的。    HSPC歸巢是指HSPC經(jīng)外周血循環(huán)輸入供體后，經(jīng)過復(fù)雜的分子間相互作用、介導(dǎo)，特異性地定位于骨髓微環(huán)境合適的“龕”位。體外抗體阻斷實驗證實，CD49d、CD11a和CD44在造血細胞與基質(zhì)細胞和細胞外基質(zhì)成分間的黏附

20、中起重要作用，而且CD11a參與了HSPC的植入，當(dāng)CD11a被抗體中和之后，HSPC明顯降低了植入水平10。因此，CD11a、CD49d及CD44分子在3種來源的CD34 細胞的高表達有利于HSPC的黏附與植入。    胎盤來源CD34 細胞高表達CD49e和CD54，其CD34 CD49e 細胞及CD34 CD54 細胞百分率明顯高于臍動脈、靜脈血（P<0.001）。Peled等10研究發(fā)現(xiàn)，臍血CD34 /CXCR4 細胞在基質(zhì)細胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）的誘導(dǎo)下，穿過骨髓基質(zhì)細胞

21、的定向遷移依賴CD49d和CD49e的共同作用，當(dāng)這2個分子被各自抗體中和后，CD34 細胞在非肥胖性糖尿病重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠（nonobese diabetic-severce combined immunodeficient mice，NOD/SCID）體內(nèi)的植入過程被阻斷。另外，CD54與CD11a這1對分子可能與黏附和穿過內(nèi)皮有關(guān)，當(dāng)CD54與CD11a之間的相互作用被阻斷后，CD34 細胞與基質(zhì)的黏附被部分破壞。    胎盤組織CD34 細胞表達CD62L的細胞百分率明顯低于臍靜脈血CD34 細胞表達。研究表明，CD62L參與了移植后CD34

22、 細胞的歸巢過程，CD62L與祖細胞上的CD34結(jié)合后，上調(diào)HSPC上白細胞功能相關(guān)抗原-1（leukocyte function-associated antigen-1，LFA-1）的親和性，而后者在細胞穿越細胞內(nèi)皮過程中起重要作用11。Watanabe等12還發(fā)現(xiàn)，在自體干細胞移植中，輸注CD34 CD62L 細胞的數(shù)量與患者體內(nèi)中性粒細胞和血小板恢復(fù)到正常水平所需時間呈負相關(guān)。但L-選擇蛋白基因敲除的小鼠未發(fā)生造血障礙13，用抗L-選擇蛋白單克隆抗體處理對動物與細胞也無任何影響。CD62在長期培養(yǎng)始動細胞（long-term culture initiating-cell，LTC-IC

23、）表面表達較低，而在相對分化成熟的造血祖細胞表達則較高14，這進一步證實了胎盤比臍帶血含有更豐富的較原始HSPC的結(jié)論。    我們所測的臍動脈、靜脈血中CD34 細胞表面的6個黏附分子的表達百分率與文獻報道一致15，這表明用先進的三色或四色流式細胞術(shù)檢測HSPC表面黏附分子表達具有明顯價值，值得今后試用。陳代雄等5及本觀察都證實了胎盤組織CD34 CD38-細胞含量高于臍帶血，Kollet等16通過觀察移植后小鼠造血干細胞表型的表達及二次移植后體內(nèi)多系造血的重建，證實CD34 CD38-細胞亞群為更早期的造血干細胞，歸巢能力較高，這些研究結(jié)果支持了我們

24、提出的，胎盤HSPC可能具有比臍血更強歸巢能力的推測。    HSPC是一個復(fù)雜的過程，需要多種因子的共同作用，本研究結(jié)果顯示，在胎盤CD34 細胞與臍動脈、靜脈血CD34 細胞都具有CD11a、CD44及CD49d 3個分子的高表達率的前提下，胎盤CD34 細胞高度表達CD49e及CD54分子，均顯著高于臍血，這也許能提示胎盤HSPC比臍血有更強的歸巢能力，值得通過功能學(xué)試驗進一步研究。    【參考文獻】 1Knudtzon S. In vitro growth of granulocyte colonies

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