液相色譜的方法開(kāi)發(fā)(一)分離方法-Waters LC School 培訓(xùn)教材_圖文

1、液相色譜的方法開(kāi)發(fā)一分離方法 第一步干什么?想辦法得到各種信息向同行了解是否做過(guò)此類樣品或有否類似 樣品的分析方法查文獻(xiàn)如CA(化學(xué)文摘儀器制造商的文獻(xiàn)如Waters對(duì)色譜柱有足夠的了解掌握分離機(jī)理自己開(kāi)發(fā)方法充分了解您自己的樣品分析時(shí)要了解哪方面的情況靈敏度的要求有多高?樣品的本底是否很復(fù)雜?有多少組份要分析?對(duì)分析的精確度準(zhǔn)確度等有多高要求? 是否因是日常檢驗(yàn)而要求方法容易使用? 分離時(shí)要了解哪方面的情況 要分離即制備的樣品量有多大?要分離的組份在樣品中的含量很高? 還是微量?是否需要保持生物活性?對(duì)分離產(chǎn)物純度的要求有多高?純度或活性的鑒定如何完成?一般的具體步驟先用一根短的色譜柱用相對(duì)

2、較高的流速使用盡可能純度高的標(biāo)準(zhǔn)品先用高強(qiáng)度的洗脫液調(diào)節(jié)k 值改變保留值調(diào)節(jié)值改變選擇性調(diào)節(jié)柱長(zhǎng)度改變柱效及分離速度請(qǐng)記住 每次改變一個(gè)參數(shù)使用文獻(xiàn)方法色譜柱填料的種類品牌是否相同? 注意文獻(xiàn)方法的流動(dòng)相是否損害色譜柱?如色譜填料品牌不同需要調(diào)整流動(dòng)相注意色譜柱的規(guī)格內(nèi)徑柱長(zhǎng) 需要調(diào)整流速進(jìn)樣量注意梯度條件 了解系統(tǒng)的滯后體積梯度色譜方法轉(zhuǎn)換如果沒(méi)有與文獻(xiàn)或要求相近的色譜柱轉(zhuǎn)換進(jìn)樣量轉(zhuǎn)換流速長(zhǎng)度內(nèi)徑進(jìn)樣量初始初始現(xiàn)在現(xiàn)在初始=L D L D L D Load Load 22(內(nèi)徑流速初始現(xiàn)在初始=D D D F F 22(反相色譜的方法開(kāi)發(fā)開(kāi)發(fā)過(guò)程實(shí)例色譜條件 色譜柱C184mm30mm 流動(dòng)

3、相乙腈/水不同的溶劑強(qiáng)度60/40 50/5040/60由強(qiáng)漸弱 流速2ml/min樣品 對(duì)羥基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben 對(duì)羥基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben 對(duì)羥基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben 改變?nèi)萘恳蜃覭 60/4050/5040/60譜圖改變選擇性通過(guò)改變流動(dòng)相改變選擇性同樣強(qiáng)度的不同溶劑 改變色譜柱62:38/42:58/72:28/232 2OHCNCHOHMeOHOHTHF離子型化合物的分離方式 使用離子交換柱離子交換法主要用于強(qiáng)陰陽(yáng)離子使用反相柱離子抑制色譜法通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值使樣品成中性離子對(duì)色譜法加入對(duì)離子使樣品呈中性離子抑制色譜離子

4、型化合物在反相色譜柱上不保留改變流動(dòng)相的pH值抑制樣品離子的電離 適用于弱酸性化合物的分離降低流動(dòng)相的pH值使樣品降低離子化使用硅膠基質(zhì)C18填料使用條件應(yīng)在填料基質(zhì)的范圍內(nèi)硅膠柱的pH在2-8較保險(xiǎn)值3-7內(nèi)常用緩沖液及其pH值名稱pKaPhosphoric Acid 磷酸 2.12 (pKa1 Formic Acid 甲酸 3.75Succinic Acid 琥珀酸 4.19 (pKa1 Acetic Acid 乙酸 4.75Succinic Acid 琥珀酸 5.57 (pKa2 Phosphoric Acid 磷酸 7.21 (pKa2 Boric Acid 硼酸 9.24Phosph

5、oric Acid 磷酸12.32 (pKa3離子抑制色譜實(shí)例在乙腈/水及pH=7時(shí)多數(shù)保留時(shí)間很短無(wú)法完全分離CHOOHOCH3COONa CHO COOHOCH3 1234離子抑制色譜的使用范圍如果 一些酸在pH低于2時(shí)還保持離子化一些堿在pH高于7時(shí)還保持離子化可以有以下的選擇離子交換色譜使用聚合物反相柱在pH高于7時(shí)用離子抑制法使用離子對(duì)色譜法 在高pH值下用離子抑制色譜柱D18-613(聚合物基質(zhì)室溫 流動(dòng)相乙腈/0.01M NH4OH + 0.01M TBA流速 1.0ml/min檢測(cè)UV-240nm樣品巴比妥的衍生物巴比妥 己瑣巴比妥 甲基苯巴比妥 速可巴比妥 離子對(duì)色譜法 在反

6、相色譜流動(dòng)相內(nèi)加入離子對(duì)試劑與樣品中可電離的組份形成對(duì)離子在反相色譜柱上分離離子型化合物離子對(duì)試劑的類型PIC A磷酸季丁銨適用于弱酸PIC B烷基磺酸鹽適用于弱堿烷基長(zhǎng)度不同形成對(duì)離子的能力不同通常有B5B6B7B8 PIC D4磷酸二丁胺適用于弱堿離子對(duì)色譜機(jī)理用離子對(duì)還是離子抑制中性物質(zhì)PIC A 酸性物質(zhì)PIC B 堿性物質(zhì)R SO 3H R C OH OR O S OH O O R OPOH O O R NH 2R 2N H R 3N (R 4N +-CH 3OH / 0.01M (NH 42HPO 4CH 3CN / H 2OCH 3OH / H 2O磺酸染料苯甲酸馬來(lái)酸雌酮磷酸地

7、塞米松氫化可的松對(duì)苯二甲酸二乙脂苊多巴胺VB2腎上腺素可待因潔爾滅離子抑制CH 3OH / 1%HAc CH 3CN / NaH 2PO 4離子對(duì)色譜的應(yīng)用 抗組胺及減充血?jiǎng)┧幬锏姆治鍪褂梦逋榛撬猁}Packing: Packing: Bondapak Bondapak C C 18Column: Column: 4 mm ID x 30cm 4 mm ID x 30cmSolvent: Solvent: Methanol/H 2O with 0.005M PENTANE Sulfonic Sulfonic Sulfonic Acid & 1% Acid & 1% Acid & 1% HOAc

8、 HOAc HOAc (50/50 (50/50Flow Rate: 2.0 ml/minDetector: UV, 254Detector: UV, 254 nm nm nm, 0.1 AUFS , 0.1 AUFS 1. 1. Maleic Maleic Maleic Acid Acid 2.2. Phenylephrine Phenylephrine 3. 3. Phenylpropanol Phenylpropanol Phenylpropanol-amine 4.4. Naphazoline Naphazoline 5.5. Phenacetin Phenacetin 6.6. Py

9、rilamine Pyrilamine使用六烷基磺酸鹽Packing: Bondapak Bondapak C C 18Column: 4 mm ID x 30cmSolvent: Methanol/Water with 0.005M HEXANE Sulfonic Sulfonic Sulfonic A c id & 1% & 1% HOAc HOAc HOAc (50/50 (50/50Flow Rate: 2.0 ml/minDetector: UV, 254Detector: UV, 254 nm nm nm, 0.1 AUFS , 0.1 AUFS1. 1. Maleic Malei

10、c Maleic Acid Acid2.2. Phenylephrine Phenylephrine Phenylephrine-HCl HCl3.3. Phenylpropanolamine Phenylpropanolamine Phenylpropanolamine-HCl HCl4.4. Naphazoline Naphazoline Naphazoline-HCl HCl5.5. Phenacetin Phenacetin6. 6. Pyrilamine Maleate Pyrilamine Maleate使用七烷基磺酸鹽1. 1. Maleic Maleic Maleic Acid

11、 Acid2.2. Phenylephrine Phenylephrine3.3. Phenylpropanolamine Phenylpropanolamine4.4. Naphazoline Naphazoline5.5. Phenacetin Phenacetin6.6. Pyrilamine PyrilaminePacking: Bondapak Bondapak C C 18Column: 4 mm ID x 30cmSolvent: Methanol/Water with 0.005M HEPTANE Sul Sul f onic onic A c id & 1% & 1% HOA

12、c HOAc HOAc (50/50 (50/50Flow Rate: 2.0 ml/minDetector: UV, 254Detector: UV, 254 nm nm nm, 0.1 AUFS , 0.1 AUFSPIC-B7的濃度很低為0.001M在樣品濃度較大時(shí) 如右圖第號(hào)峰由于PIC不足而分叉 離子對(duì)色譜分析水溶性維生素NCONH 2NH 3C HOCH 2OHCH 2OH NN NNH 3C H 3COO CH 2CH CH CH HO HOHO CH 2O H NNH 3CNH 2CH 2NSCH 2CH 2OHCH 3 Cl -+1. Niacinamide 煙酰胺2. Py

13、ridoxine 吡哆素 VB63. Riboflavin 核黃素 VB24. Thiamine 硫胺素VB 1用不同的離子對(duì)試劑 BondaPak C18 3.9mm 300mm 溶劑 1.MeOH/H2O,PIC-B7 2.MeOH/H2O,PIC-B5 3.MeOH/H2O,PIC-B7/B5 色譜柱 1.如用PIC-B7 在 分開(kāi)的情 況下 保留時(shí)間 太長(zhǎng) 2.如用PIC-B5 峰 分不 開(kāi) 3.如用PIC-B7 加B5 各組份 分開(kāi) 且保留 時(shí)間合適 離子對(duì)色譜 - 水溶性維生素 保留時(shí)間與PIC試劑B之間的關(guān)系 36ml 保留體積 ml 胺 1 B (V 硫 核黃素(VB2 6 素(VB 吡哆 煙酰胺 4ml B5 50%(B5/