細菌的基因預(yù)測以及注釋

1、Whole-genome Annotation of an A.baumannii strain A.baumannii ACICU 摘 要 隨著新一代測序技術(shù)的進展，微生物全基因組測序的成本大大削減，DNA序列的生成速度已遠遠超過其基因的注釋速度。功能基因組學的爭辯已經(jīng)成為當今爭辯的主流。然而如此多的數(shù)據(jù)對現(xiàn)有的基因注釋工具提出了巨大的挑戰(zhàn)。本爭辯通過對A.baumanii ACICU染色體序列使用GeneMarks進行基因猜測，猜測到了3718個基因，然后使用RAST進行基因注釋，共注釋到了3683個功能基因，將得到的結(jié)果與原文獻中所注釋到的基因進行對比。最終得到結(jié)論，基因的猜測與注釋都需

2、要綜合不同軟件的結(jié)果進行分析，才能得到較為精確的結(jié)果。本爭辯為原核生物全基因組的注釋提方法供了參考。關(guān)鍵字：基因注釋 全基因組 鮑曼不動桿菌 GeneMarks RAST名目1.引言（Introduction）31.1.背景介紹31.2.全基因組注釋軟件31.3.A.baumannii ACICU相關(guān)42.材料與方法（Methods and Materials）52.1.使用GeneMarks進行ORF猜測52.2.使用RAST進行功能基因注釋63.結(jié)果與爭辯（Results and Discussion）83.1.使用GeneMarks猜測ORF的結(jié)果以及分析83.2.使用RAST進行功能基

3、因注釋結(jié)果以及分析93.3.綜合分析10參考文獻101. 引言（Introduction）1.1. 背景介紹 一個完整的基因組是指組成一個生物體全部DNA的集合。想要完全了解一個生命體，首先需要知道它的全基因組序列，由于生命體本身的遺傳信息是不會輕易轉(zhuǎn)變的?；蚪M爭辯包括兩方面內(nèi)容：（1）以全基因組測序為目標的結(jié)構(gòu)基因組學（2）以基因功能鑒定為目標的功能基因組學，也叫后基因組（postgenome）爭辯。其中結(jié)構(gòu)基因組學的重點就是利用高通量測序儀進行全基因組測序。隨著測序的完成，功能基因組學爭辯成為爭辯的主流。功能基因組學的爭辯內(nèi)容很多，主要包括：基因組表達調(diào)控的爭辯、基因信息的識別和鑒定、基

4、因功能信息的提取和鑒定、基因多樣性分析、比較基因組學等。隨著新一代測序技術(shù)的進展，微生物全基因組測序的成本大大削減，DNA序列的生成速度已遠遠超過其基因的注釋速度。現(xiàn)階段超過300個細菌基因組序列已可以在公開數(shù)據(jù)庫中查詢，同時有更多的微生物基因組序列測序工作即將完成并在近期發(fā)布。如何利用這些原始序列信息來更好的了解微生物中諸如基因的識別和注釋、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能等生物學學問，這是我們現(xiàn)階段要做的重要工作。 傳統(tǒng)上，人們用試驗方法驗證基因組中的蛋白質(zhì)編碼基因，但這種方法費時費勁，且?guī)в休^大的盲目性。因此，基因組注釋不行避開要依靠自動化注釋軟件，接受自動化注釋對生物序列特殊是大規(guī)模的基因組序列進行

5、分析和注釋，從而對傳統(tǒng)生物學試驗產(chǎn)生有益的方向性指引是當前爭辯的熱點。然而，自動化注釋必定會引進和傳播一些錯誤的注釋信息，其結(jié)果往往需要人工修正，數(shù)據(jù)庫中收錄的已測序和注釋的基因序列數(shù)量巨大，手工修正全部的注釋序列也是不行行的1?；蚪M注釋的精確性已變得越來越為重要，新的注釋方法不斷研發(fā)，如依據(jù)序列組成特征或核苷酸消滅頻率模式等多種參數(shù)對蛋白質(zhì)編碼基因起始位點、假蛋白基因和RBS位點的的識別方法。這些爭辯加上不斷完善的數(shù)據(jù)庫信息和新的試驗驗證學問，在不久的將來無疑會對基因組注釋的精確度起到更好的作用。1.2. 全基因組注釋軟件目前，針對基因組學爭辯的各個方向都有很多現(xiàn)成的軟件。這些軟件都是爭辯

6、者或商業(yè)公司針對某些分析方法開發(fā)的，為后來爭辯者供應(yīng)了巨大的便捷?；蚪M注釋是在得到全基因組序列后首先要做的。它是利用生物信息學方法，對基因組全部基因的生物學功能進行功能注釋，包括基因猜測和基因功能注釋兩個方面。目前已經(jīng)有很多的基因猜測工具或者在線注釋網(wǎng)站?；虿聹y的方法主要有 3 種：(1)分析mRNA和EST數(shù)據(jù)直接得到結(jié)果；(2)通過相像性比對從已知基因和蛋白質(zhì)序列得到間接證據(jù)；(3)基于各種統(tǒng)計模型和算法從頭猜測，比如隱馬可夫模型。其中通過相像性比對得到猜測基因的方法最常見。例如，現(xiàn)在流行的做法是先通過 Glimmer、GeneMarks等軟件猜測出基因組的ORF。然后通過 Blast

7、方法將ORF同其他物種的基因進行比對。有同源基因的ORF被注釋為同樣功能的基因，沒有同源性的ORF被舍去或注釋為假說蛋白（hypothetical protein）。由于注釋需要大量的數(shù)據(jù)庫，為了使注釋變得簡潔，一些爭辯機構(gòu)將不同功能的注釋軟件整合在一起，供應(yīng)在線的注釋服務(wù)。如 RAST2、Xbase等，NCBI的PGAAP能供應(yīng)人工的注釋服務(wù)。這些網(wǎng)站只需要用戶將序列和序列的所屬物種分類信息提交即可。注釋好的結(jié)果為 gbk 格式文件（包含序列和注釋信息）3。GeneMarks4 軟件的原理都是使用統(tǒng)計學模型的從頭猜測(ab initio)方法，不依靠任何先驗學問和閱歷參數(shù)，通過描述DNA序列

8、中核苷酸的離散模型，利用編碼區(qū)和非編碼區(qū)的核苷酸分布概率不同來進行基因猜測。GeneMarks是不需要人為干預(yù)和相關(guān)DNA或rRNA基因的資料即可對新的細菌基因組進行猜測，測試表明GeneMarks對GeneBank數(shù)據(jù)庫中已注釋的枯草芽孢桿菌的猜測精確度達到82.9%，而對已通過試驗方法證明注釋功能的大腸桿菌的猜測高達93.8%，其對新測序基因組的猜測與Glimmer存在同樣問題，即相當一部分基因在數(shù)據(jù)庫并不能發(fā)覺同源，只能作為假蛋白基因存在。如何在沒有明確試驗證據(jù)的前提下鑒定此類基因猜測的精確性，切實可行的方法就是綜合利用多個猜測軟件對猜測結(jié)果進行比較，分析其中的異同點1。1.3. A.b

9、aumannii ACICU相關(guān)本爭辯所接受的菌株A.baumannii ACICU是鮑曼不動桿菌比較有代表性的菌株，關(guān)于這株菌的具體信息可查看Iacono M et.al5。近年來由于鮑曼不動桿菌的耐藥性的不斷增加，關(guān)于鮑曼不動桿菌耐藥機制進行了大量爭辯，已經(jīng)有35株鮑曼不動桿菌完成了全基因組基因測序與注釋。序列大小/bp編碼區(qū)比例/%GC%猜測基因數(shù)（ORF）編碼蛋白基因數(shù)（CDS）染色體序列390411684.8739.0337583670上表格顯示了A.baumannii ACICU 菌株的全基因組的注釋狀況其由整個染色體以及兩個質(zhì)粒組成。其中染色體大小為3904116bp，編碼區(qū)占整

10、個基因組的84.78%，含有猜測基因數(shù)（ORF）為3758個，其中編碼蛋白質(zhì)的基因數(shù)為3670個5。上圖為NCBI上所顯示的A.baumannii ACICU的相關(guān)狀況，其中編碼蛋白質(zhì)基因數(shù)為3613，與原文獻中所載有較大差別，可能是隨著時間的推移，基因注釋方法有所改進，有所變化所致。本爭辯主要以A.baumannii ACICU染色體序列為例對基因猜測與注釋的方法進行分析，以找到合適的基因猜測與注釋的方法。2. 材料與方法（Methods and Materials）下面我們利用從NCBI上下載的A.baumannii ACICU全基因組染色體序列（不包含質(zhì)粒序列）（.fasta格式）為例，

11、分別使用GeneMarks（/GeneMark/genemarks.cgi）進行ORF（開放閱讀框）基因猜測， RAST（/）進行功能基因（CDS）注釋，對比原結(jié)果進行分析。2.1. 使用GeneMarks進行ORF猜測（1）第一步是上傳A.baumanii ACICU染色體序列，并設(shè)置合適的參數(shù)，填加自己的郵箱。全部設(shè)置好之后，點擊Start GeneMarks開頭注釋。如下圖所示：（2）第一步上傳結(jié)束序列之后，會消滅如下界面，提示序列已成功提交，注釋好的文件會發(fā)到所填郵箱。2.2. 使用RAST進行功能基因

12、注釋（1）上傳A.baumanii ACICU（.fasta格式）序列，上傳結(jié)束后點擊Use this data and go to step 2進行下一步。如下圖所示：（2）其次步填加必需的的參數(shù)，Domain選擇Bacteria，Genetic Code選擇11，然后點擊Use this data and go to step 3進行下一步操作。如下圖所示：（3）如下圖所示，選擇好合適的參數(shù)后點擊Finish the upload，即可等待結(jié)果，注釋結(jié)束后，其會發(fā)郵件告知3. 結(jié)果與爭辯（Results and Discussion）3.1. 使用GeneMarks猜測ORF的結(jié)果以及分析

13、使用GeneMarks進行猜測后，生成了gms.out gms.out.faa gms.out.fnn gms.out.ps四個文件：其中g(shù)ms.out文件如下顯示（其中一部分，使用linux系統(tǒng)cat或者head命令查看）： Gene Strand LeftEnd RightEnd Gene Class # Length 1 - 76 468 393 1 2 - 506 2974 2469 1 3 - 3027 4109 1083 1 4 - 4124 5272 1149 1 5 - 5370 6767 1398 1 6 + 7438 7572 135 1 7 + 7602 7994 393

14、 1 8 + 8005 8325 321 1 9 + 8331 10091 1761 1 10 + 10182 11537 1356 1 3711 + 3894879 3896006 1128 1 3712 + 3896134 3896979 846 1 3713 - 3897035 3897370 336 1 3714 - 3897495 3898499 1005 1 3715 - 3898842 3899849 1008 1 3716 - 3900105 3901109 1005 1 3717 + 3901366 3903297 1932 1 3718 + 3903549 3904106

15、558 1其中g(shù)ms.out.faa氨基酸序列文件顯示如下（其中之一）：>gene_3718|GeneMark.hmm|185_aa|+|3903549|3904106>gi|184156320|ref|NC_010611.1| Acinetobacter baumannii ACICU, complete genomeMNFIDFITNFEQFLPILIQEYGAWVYAILFLIIFSETAFVFMFFLPGDSLLLTVGALCSVVELMHLGYMITLLTVAATLGYIVNYSIGRHFGNRIFEAKSRFIKKEYLNKTNRYFLQHGGKTILLARFIPFAR

16、SFAPLAAGSSNMSYGKFLIYNVAGAILWICILLTAGYLFGHALIQVTDFVEN其中g(shù)ms.out.fnn核苷酸序列如下所示，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA TGA和TAG（其中之一）：>gene_3718|GeneMark.hmm|558_nt|+|3903549|3904106>gi|184156320|ref|NC_010611.1| Acinetobacter baumannii ACICU, complete genomeATGAATTTTATTGATTTTATTACTAATTTTGAACAATTTTTACCTATTTTGATTCAGGAG

17、TATGGTGCATGGGTTTATGCCATACTCTTTTTGATTATTTTTTCTGAAACTGCTTTTGTGTTTATGTTCTTTTTACCTGGAGATAGCTTACTTTTAACTGTAGGTGCACTGTGCTCGGTGGTTGAACTGATGCATCTTGGTTATATGATTACTCTGCTCACCGTTGCAGCAACATTAGGCTATATCGTCAATTATTCTATTGGCCGCCATTTTGGAAACCGTATTTTTGAAGCAAAATCACGTTTTATTAAAAAAGAATATTTGAATAAAACGAACCGCTATTTCTTGCAACATGGCGGT

18、AAAACTATTCTTTTAGCACGTTTTATTCCTTTCGCACGTTCTTTTGCACCCCTCGCTGCCGGCTCAAGCAATATGAGCTATGGAAAATTTTTGATTTACAATGTGGCAGGAGCTATTTTGTGGATCTGCATCCTTTTAACGGCTGGCTACCTATTTGGCCATGCACTCATTCAAGTTACAGATTTTGTTGAAAATTAA由此可知A.baumannii ACICU全基因組經(jīng)GeneMarks猜測到了3718個基因。3.2. 使用RAST進行功能基因注釋結(jié)果以及分析 以上兩圖是使用RAST對A.baumannii ACICU

19、染色體序列進行注釋的結(jié)果菌株A.baumannii ACICU染色體基因組經(jīng)RAST功能基因注釋，共注釋到3683個功能基因。其中分布于不同功能子系統(tǒng)（457）的有1831個，確定的基因（non-hypothetical）有1736個，不確定（hypothrtical）的有95個；其余的編碼基因不分布于這些不同功能的子系統(tǒng)中，共有1852個，其中確定的有908個，不確定的有944個。3.3. 綜合分析對于A.baumaniiACICU染色體序列，由GeneMarks猜測到3718個基因，由RAST注釋到3683個編碼蛋白基因，與原文獻結(jié)果含有猜測基因數(shù)（ORF）為3758個，其中編碼蛋白質(zhì)的基

20、因數(shù)為3670個相比有所不同。其中猜測基因數(shù)比原文獻少了有40個，差別較大，原文獻聯(lián)合使用GeneMarks與Glimmer對比猜測，效果較好；注釋基因數(shù)相差比原文獻多13個，差別不大，原文獻中綜合使用COG與KEGG數(shù)據(jù)庫對猜測到的蛋白序列進行注釋，說明RAST注釋結(jié)果還是比較牢靠的。整個過程只是基因注釋的初始工作，要想得到完整精確的基因注釋結(jié)果，需要使用多個軟件進行注釋，對于不能精確注釋的基因還需要單獨進行注釋，最終綜合分析得到結(jié)果。參考文獻：1.黃勇: 基于高通量測序的微生物基因組學爭辯. 中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院, 2013.2.Aziz RK, Bartels D, Best AA, Dejongh M, Disz T, Edwards RA, Formsma K, Gerdes S, Glass EM, Kubal M: The RAST Server: Rapid Ann