蛋白質(zhì)連接技術(shù)ok

1、蛋白質(zhì)連接技術(shù)主 編洪孝莊 孫曼霽編 著 者洪孝莊 孫曼霽 龔雄麒仲伯華 沈倍奮 陳泮藻李春海 盧秀桂 何云漢中 國 醫(yī) 藥 科 技 出 版 社前 言 隨著生物醫(yī)學(xué)研究的迅速發(fā)展，在其相應(yīng)的研究領(lǐng)域中也出現(xiàn)許多新穎的應(yīng)用技術(shù)，蛋白質(zhì)連接技術(shù)即是其一。蛋白質(zhì)連接技術(shù)的出現(xiàn)最早是在本世紀(jì)20年代，在化學(xué)免疫研究中，首次合成人工抗原時(shí)已開始使用。此后，在免疫學(xué)研究中，特別是在免疫標(biāo)記技術(shù)中廣為應(yīng)用并迅速發(fā)展。從40、50年代的免疫熒光技術(shù)，60年代的放射免疫技術(shù)，到70年代的酶免疫技術(shù)，及在此前后出現(xiàn)的發(fā)光免疫技術(shù)、膠體金免疫技術(shù)和稀土元素免疫標(biāo)記技術(shù)等都大大豐富和發(fā)展了蛋白質(zhì)連接技術(shù)。更為突出的是

2、在1975年單克隆抗體的研制成功，以及化學(xué)家們新合成的多種異型雙功能交聯(lián)劑的出現(xiàn)，更將蛋白質(zhì)連接技術(shù)的應(yīng)用推向新天地。近些年來，在國內(nèi)外非常活躍的研究領(lǐng)域?qū)蛩幬?、免疫毒素相載體釋放藥物的研究中，亦廣泛采用此類蛋白質(zhì)連接技術(shù)。如將某種藥物(例如抗腫瘤藥物)或毒素與載體分子(如單克隆抗體或受體)進(jìn)行交聯(lián)組成導(dǎo)向藥物，人們譽(yù)之為“生物導(dǎo)彈”。應(yīng)用這種技術(shù)，將抗腫瘤藥物(如多諾霉素、絲裂霉素、氨甲蝶吟等)或毒素(如白喉毒素、蓖麻毒素、紅豆毒素等)作為彈頭藥物與腫瘤單克隆抗體作導(dǎo)向載體所制成的導(dǎo)向藥物，對相應(yīng)腫瘤細(xì)胞的殺傷力大大超過一般抗腫瘤藥物。毒素大多都是蛋白質(zhì)，所以，上述蛋白質(zhì)連接技術(shù)則可選用于

3、導(dǎo)向藥物的制備。更為可喜的是，近些年來，在分子生物學(xué)研究中，特別是在核酸探針的研究與應(yīng)用中，蛋白質(zhì)連接技術(shù)也大顯身手，有人稱其為分子生物學(xué)的支撐技術(shù)。隨著這一技術(shù)的應(yīng)用及其在相關(guān)研究領(lǐng)域的不斷開拓，蛋白質(zhì)交聯(lián)方法也不斷改進(jìn)和漸趨完善，使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用和重視。 目前，蛋白質(zhì)連接技術(shù)不僅廣泛應(yīng)用于人工抗原的合成，而且在小分子物質(zhì)(如毒物、藥物、激素等)和生物大分子的標(biāo)記免疫分析(放射免疫分析RIA、酶免疫分析EIA、熒光免疫分析FIA、發(fā)光免疫分析CIA、時(shí)間分辨免疫分析TrFIA)、標(biāo)記受體分析(放射受體分析RRA、酶受體分析ERA)及競爭蛋白結(jié)合分析等配體結(jié)合分析方法中，普遍

4、用作標(biāo)記配體的制備方法。此外，在基因探針標(biāo)記、腫瘤標(biāo)志和診斷研；究中也廣為采用。 蛋白質(zhì)連接技術(shù)是一種具有理論研究和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的新技術(shù)，近幾年來快速發(fā)展和更趨成熟。但是，在實(shí)際應(yīng)用中，它所涉及的問題較多，無論從理論上或在實(shí)踐中都還存在一些需要進(jìn)一步闡明和有待解決的問題。現(xiàn)在，涉及這一技術(shù)的國內(nèi)外文獻(xiàn)及著述不少見，也是大家非常數(shù)悉的。然而，至今未見到對此類技術(shù)較為全面系統(tǒng)的論述。為滿足有關(guān)科技研究工作的需要，我們幾位作者，根據(jù)多年科研實(shí)踐之所得，并參閱有關(guān)文獻(xiàn)，從介紹化學(xué)反應(yīng)的主要類型出發(fā)，以生物醫(yī)學(xué)研究中的實(shí)際應(yīng)用為目的編寫本書，愿為同行提供有用的研究工具。 由于本書涉及內(nèi)容較廣，作者水平有

5、限，經(jīng)驗(yàn)不足，書中難免有謬誤之處，敬請讀者批評指正。 洪孝莊軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所1992年5月第一章 蛋白質(zhì)交聯(lián)方法及其應(yīng)用仲伯華 龔雄麒(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所)蛋白質(zhì)交聯(lián)系指將小分子物質(zhì)（如藥物、半抗原等）或大分子物質(zhì)(如酶、蛋白毒素等)以共價(jià)鍵的方式連接于蛋白質(zhì)分子，以制備人工抗原、酶標(biāo)抗體、載體釋放藥物、抗體導(dǎo)向藥物和免疫毒素等。隨著放射免疫分析法、酶標(biāo)免疫技術(shù)、載體藥物學(xué)和導(dǎo)向物學(xué)的發(fā)展，蛋白質(zhì)交聯(lián)技術(shù)的方法和手段也不斷改進(jìn)和完善，并且在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到愈來愈廣泛的應(yīng)用。蛋白質(zhì)交聯(lián)方法首先發(fā)展于人工抗原的制備研究。自70年前Landsteiner第一次合成人工抗原以

6、來，人們將許多沒有抗原性的小分子物質(zhì)(半抗原)如化學(xué)藥物、神經(jīng)遞質(zhì)和激素等與蛋白質(zhì)或多糖等載體大分子共價(jià)結(jié)臺；使其具備抗原性，以誘發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體，用于放射免疫分析等。為了使放射免疫分析達(dá)到靈敏度高、特異性強(qiáng)的要求，前人對半抗原和蛋白質(zhì)連接的方法進(jìn)行了大量的研究，建立了重氮化法、戊二醛法、混合酸酐法、二異氰酸酯法及鹵代硝基苯法等交聯(lián)技術(shù)近10多年來發(fā)展起來的酶標(biāo)免疫檢測技術(shù)，要求制備保持酶的生物活性和抗體的免疫結(jié)合活性的酶抗體偶合物。常用的交聯(lián)方法如戊二醛法、碳二亞胺法和混合酸酐法不可避免地要產(chǎn)生酶或抗體的自身交聯(lián)產(chǎn)物或多聚物，致使交聯(lián)效率降低、結(jié)合物活性減弱。為了克服這一不足，人們發(fā)展了

7、異型雙功能交聯(lián)試劑，如N羥基琥珀酰亞胺3(2吡啶基二硫)丙酸酯，以實(shí)現(xiàn)控制交聯(lián)，提高交聯(lián)反應(yīng)的選擇性和交聯(lián)產(chǎn)物的均一性。將藥物與大分子載體連接，制備藥物一載體結(jié)合物，以改善和控制藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，實(shí)現(xiàn)緩釋給藥和定向給藥，提高生物利用度和治療指數(shù)。這是現(xiàn)代藥物研究領(lǐng)域一個(gè)嶄新的分支。載體藥物必須能夠在體內(nèi)定量、定位釋放原型藥物，因此要求設(shè)計(jì)pH敏感或特定酶敏感的偶聯(lián)鍵。導(dǎo)向藥物的發(fā)展對蛋白質(zhì)交聯(lián)方法提出了更高的要求。早在1906年，Ehrlich就提出了靶向給藥的設(shè)想。隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，這一設(shè)想不斷得到具體的實(shí)現(xiàn)。單克隆抗體作為導(dǎo)向載體的出現(xiàn)，更使導(dǎo)向藥物的研究成為當(dāng)代藥物研究中最活躍和

8、最引人注目的領(lǐng)域之一，而其中研究得最廣泛的是腫瘤治療的抗體導(dǎo)向研究。其載體主要有針對腫瘤細(xì)胞表面相關(guān)抗原的抗體及其片斷，腫瘤細(xì)胞表面受體的模擬配基。這些載體與藥物或毒素分子連接而成的偶合物，能夠選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞，被譽(yù)為“生物導(dǎo)彈”。為了最大限度地保持導(dǎo)向載體和藥物彈頭的生物活性，同時(shí)實(shí)現(xiàn)最大的藥物載運(yùn)量，人們不斷創(chuàng)新交聯(lián)劑，改進(jìn)交聯(lián)方法，發(fā)展了一批新的各具特性的異型雙功能交聯(lián)劑，提高了導(dǎo)向藥物的有效性和實(shí)用性。隨著新的交聯(lián)試劑和交聯(lián)方法的出現(xiàn)，使得放射免疫、酶標(biāo)免疫和導(dǎo)向藥物的研究不斷深入；而后者的發(fā)展又反過來促進(jìn)蛋白交聯(lián)技術(shù)趨于成熟。目前的交聯(lián)方法可以，將任一個(gè)半抗原或細(xì)胞毒分子以一定方

9、式與載體交聯(lián)，獲得所需的偶合物。下面分別介紹蛋白質(zhì)交聯(lián)中常用的試劑、方法及其應(yīng)用。一、交聯(lián)方法 一般說來，蛋白分子中可以用于交聯(lián)的活性基團(tuán)有游離氨基(如賴氨酸的c氨基或末端氨基)、游離羧基(如天冬氨酸殘基，谷氨酸殘基及末端羧基)、苯基(苯丙氨酸、色 氨酸或酪氨酸)、酚基(酪氨酸)、巰基(半胱氨酸)、羥基(絲氨酸或蘇氨酸)、咪唑基(組氨酸)、吲哚基(色氨酸)或胍基(精氨酸)等。為了避免蛋白質(zhì)變性及其生物活性的損失，藥物或半抗原等與蛋白的交聯(lián)應(yīng)采用具有中等反應(yīng)活性的試劑，在溫和的條件(如接近中性的pH、室溫、水溶液中)進(jìn)行。 (一)重氮化法 含芳香胺的化合物，可以與亞硝酸反應(yīng)形成重氮鹽，然后直接連

10、接于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸殘基上酚羥基的鄰位，即得以偶氮鍵相聯(lián)的結(jié)合物。這種重氮鹽也能與組氨酸殘基上的咪唑環(huán)或色氨酸殘基的吲哚環(huán)反應(yīng)： 本方法副反應(yīng)較多，故一般限于人工抗原的制備。 (二)戊二醛法 同型雙功能交聯(lián)劑戊二醛的兩個(gè)醛基可以分別與兩個(gè)相同或不同分子上的伯氨基形成Schiff氏堿，將兩分子以五碳鏈的橋連接起來。 戊二醛連接反應(yīng)是最溫和的交聯(lián)反應(yīng)之一，可在440溫度范圍，pH608。0的 緩沖水溶液中進(jìn)行，但是緩沖組份中不得含有氨基化合物。以硼氫化鈉或氰基硼氫化還原Schiff氏堿可以形成穩(wěn)定的單鍵；根據(jù)對偶聯(lián)鍵的不同要求，還原步驟也可省略。但是，本交聯(lián)方法易形成相同蛋白間的連接；產(chǎn)物的均一

11、性較差。因此，多用于酶標(biāo)抗體的制備。 (三)過碘酸鹽氧化法1 糖類或含糖基化合物分子中的鄰二醇結(jié)構(gòu)可被過碘酸鈉氧化為醛基，然后與蛋白分子中的氨基形成Schiff氏堿： 與戊二醛的交聯(lián)反應(yīng)相似，過碘酸鈉氧化法比較溫和，可在常溫和中性pH的條件下進(jìn)行。這是一個(gè)兩步反應(yīng)，第一步生成醛基衍生物后，過量的過碘酸鹽必須除去或消耗后，方可進(jìn)行與蛋白交聯(lián)的第二步反應(yīng)。(四)混合酸酐法 半抗原或藥物及其衍生物分子中的羧基可以在三級胺存在下與氯甲酸異丁酯反應(yīng)，生成活潑中間體混合酸酐，然后與蛋白載體上的伯氨基反應(yīng)，形成酰胺交聯(lián)鍵：本反應(yīng)過程簡單，毋需制備和分離中間產(chǎn)物。(五)碳二亞胺法 碳二亞胺是一類很強(qiáng)的脫水劑，

12、能使羧基和氨基脫水形成酰胺鍵。在反應(yīng)時(shí)，一種分子中的羧基先與碳二亞胺反應(yīng)生成一個(gè)加成中間產(chǎn)物，再與另一分子上的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵，實(shí)現(xiàn)兩者的交聯(lián)： 除戊二醛外，碳二亞胺是常見的另一類交聯(lián)劑，最早用于藥物化學(xué)和有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域；脂溶性的二環(huán)己基碳二亞胺至今仍被廣泛用于多肽合成領(lǐng)域，但其反應(yīng)必須在有機(jī)溶劑中進(jìn)行，不適用于蛋白質(zhì)交聯(lián)。水溶性的1乙基3(3二甲基氨基丙基)碳二亞胺 (EDC)等的出現(xiàn)，使這一縮合反應(yīng)成功地用于蛋白質(zhì)交聯(lián)中。本交聯(lián)反應(yīng)條件溫和即使在冷卻(0)條件下，也能于中性pH中進(jìn)行。但是，由于碳二亞胺的縮合反應(yīng)沒有選擇性；易形成蛋白分子間的自身聚合，產(chǎn)生非均一性產(chǎn)物；先將含羧基的藥物或半抗原分子與EDC反應(yīng)，活化羧基后，再加入蛋白反應(yīng)物，可以減少蛋白分子交聯(lián)。. (六)活潑酯法2含有羧基的半抗原或藥物在二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的作用下，與N羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)，生成活潑酯衍生物，后者與載體蛋白上的氨基反應(yīng)，形成以酰胺鍵連接的偶合物：本法是對碳二亞胺法的改進(jìn)：由于避免了碳二亞胺對蛋白的直接作用，從而避免了蛋白分子間的交聯(lián)。活潑酯法在導(dǎo)向藥物的研究中得到廣泛的應(yīng)用。(七)多元酸酐法3半抗原或藥物分子中的羥基或氨基與琥珀酸酐、順烏頭酸酐等在無水吡啶催化下反應(yīng)，形成單酯或單酰胺衍生物，引入游離羧基，然后以活潑酯法或碳二亞胺法與蛋白交