藜麥皂甙提取及萌芽對皂甙含量的影響

1、基金項目：六盤水市級科技計劃項目（52020-2015-02）收稿日期：2016-10-31作者簡介：黃金，女，1991年出生，碩士，食品科學通訊作者：秦禮康，男，1965年出生，教授，食品科學藜麥皂甙提取及萌芽對皂甙含量的影響黃金 秦禮康 石慶楠 文安燕（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴陽 550025 ）摘要: 利用響應(yīng)面分析法對藜麥籽粒皂甙的提取條件進行探索，并研究萌芽對藜麥皂甙含量的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取乙醇提取分數(shù)、料液比和浸提溫度進行三因素三水平的Box- Behnken試驗設(shè)計，通過響應(yīng)面分析法對提取條件進行了優(yōu)化；同時在優(yōu)化條件下測定萌芽144 h藜麥中的皂甙含量變化。

2、結(jié)果表明，在560 nm波長下，最佳提取條件為乙醇體積分數(shù)65%，料液比140，浸提溫度60 ，皂甙提取量為5.56 mg/g。萌芽試驗結(jié)果表明，萌芽初期（6 h內(nèi)）皂甙含量迅速下降，在642 h期間含量保持平穩(wěn)，42 h后逐漸升高直至96 h時達最高值7.80 mg/g，萌芽120 h后皂甙含量開始下降。關(guān)鍵詞：藜麥 萌芽 皂甙 響應(yīng)面分析中圖分類號：S512.9文獻標識碼：A文章編號：1003-0174（）Optimizing extraction process of quinoa saponins and investigating its variation during sprou

3、ting HuangJinQinLikangShiQingnanWen Anyan(School of liquor and food engineering，GuizhouUniversity，Guiyang 550025)Abstract:Response surface design was applied to optimize the extractionprocess of quinoa seed saponin.And then the effect of sprouting on saponin content was investigated. On the basis of

4、 single factor experiments, alcohol concentration, solid-liquid ratio and extraction temperature were selected for a three-factor-three-level Box-Behnken experimental design and the response surface methodology was applied to optimize the extraction conditions. The desired amount of saponin was 5.56

5、 mg/g under the condition: 65% ethanol, solid-liquid ratio of 140 and extraction temperature at 60 . The germinating testresults showed that the saponin was quickly decreased in the early bud, kept steady during 6 42 hours and then increased gradually with sprouting after 42 hours. The peak value (7

6、.80 mg/g) was reached on the fourth day, after that, it declined slowly with germinating after 120 hours. Key words:quinoa, germinated,saponins,response surface design藜麥(Chenopodium quinoa Willd.)，不僅富含蛋白質(zhì)及鈣、鐵、鋅和維生素E等微量營養(yǎng)素，而且含有全部必需氨基酸，具有提高人群健康，預(yù)防癌癥、過敏、炎癥以及降低心血管疾病12等多種疾病發(fā)生的潛在功效。古代印加人稱其為“糧食之母”和“安第斯山的真金

7、”34。國際營養(yǎng)學家稱其為“營養(yǎng)黃金”、“超級谷物”、 “未來食品”5。FAO 將藜麥評為“高營養(yǎng)價值的食物”6。聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)認為藜麥是唯一一種可滿足人體基本營養(yǎng)需求的單體植物,并正式推薦藜麥為最適宜人類的全營養(yǎng)食品，將2013年設(shè)立為“國際藜麥年”7。藜麥具有豐富的營養(yǎng)價值，但藜麥中存在的抗營養(yǎng)因子皂甙，略有苦澀味且具有潛在毒性8，阻礙了藜麥在食用、加工和推廣等方面的運用。藜麥皂甙主要以三萜皂甙的形式存在，含量在0.14%2.30%9之間，隨著對皂甙的進一步了解，人們更加關(guān)注皂甙的生物活性及其對健康的作用。具已有研究表明，皂甙是一類具有抗炎10、抗過敏11、抗氧化12、抗糖尿病1

8、3、降膽固醇14等生物活性的物質(zhì)，是許多中藥的有效成分。藜麥皂甙的去除、提取及再利用一直是困擾研究者的難題。傳統(tǒng)的流動水沖洗方法會造成大量的水資源浪費，同時也損失了皂甙的藥用價值。種皮打磨30%15，浸泡水洗16亦可有效降低種皮皂甙含量。種子萌發(fā)是高等植物生命活動最強烈的一個時期，涉及到一系列形態(tài)和生理、生化的變化。通過發(fā)芽處理谷物可以改善它們的口感，提高營養(yǎng)成分的含量和利用率，以及降低抗營養(yǎng)成分的含量1718。澳大利亞學者在處理藜麥皂甙時發(fā)現(xiàn)，長時間的浸泡會導致藜麥發(fā)芽19。Ren S等20人發(fā)現(xiàn)苦蕎種子萌芽處理期間總酚、總黃酮、蘆丁含量逐漸增加，并在第9天到最大值。這些現(xiàn)象在開發(fā)芽類食品方

9、面受到了人們密切關(guān)注21。目前，藜麥商品糧皂甙含量標準及其檢測方法尚不統(tǒng)一，提取工藝及條件各不相同。趙文婷22在乙醇濃度72%、提取溫度71.5 、料液比120.8、提取時間147 min、吸收波長546 nm條件下測得藜麥麩皮的平均皂甙得率為1.685%。任卓偉等16在乙醇體積分數(shù)70%、料液比130、提取溫度50 、吸收波長560 nm條件下測得藜麥的皂甙含量為10.709 mg/g。杜靜婷等23在料液比391、乙醇體積分數(shù)74%、超聲時間33 min、吸收波長550 nm條件下測得藜麥糠皂甙得率為23.371 mg/g。本研究在目前通用的藜麥皂甙提取方法的基礎(chǔ)上，運用響應(yīng)面法探索適宜的提

10、取條件，對萌芽144 h內(nèi)的藜麥皂甙含量的變化進行動態(tài)監(jiān)測，旨在為藜麥皂甙的綜合利用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1 試劑與材料齊墩果酸標準品:Sigma;藜麥:甘肅省農(nóng)業(yè)科學院。1.2 儀器與設(shè)備Spectra Max 190 酶標儀: Molecular Devices；MK-C315豆芽培育箱: MEIKONG；HYG-A全溫搖瓶機:大倉市實驗設(shè)備廠；FD-1A-50冷凍干燥機:北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；HC-700型超高速粉碎機:永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司。1.3 方法1.3.1 標準溶液的制備參考任卓偉等16，趙文婷22的方法，選用齊墩果酸為標準品。準確稱取齊墩果酸標準品50 mg

11、，加少量無水乙醇溶解后定容于50 mL的容量瓶中，制成1 mg/mL標準溶液。1.3.2 標準曲線的繪制16用移液槍準確地吸取 0、50、100、200、400 L的標準溶液，分別置于干燥的蒸發(fā)皿中，60 水浴蒸干取出；依次加入0.8 mL 5%的香草醛冰醋酸溶液和3.2mL高氯酸，搖勻；用冰水浴冷卻20 min，加入20 mL冰醋酸，搖勻，靜置15 min。取400 L的標準品用酶標儀于500600 nm處進行掃描，選定最大吸收波長。以最大吸收波長處各濃度標準品的吸光度值(Abs)為橫坐標，以相應(yīng)齊墩果酸標準品濃度/mg/mL為縱坐標，繪制標準曲線。皂甙提取量根據(jù)標準曲線按下式計算: 皂甙提

12、取量/mg/g= CV/m其中，C為根據(jù)標準曲線求得的皂甙質(zhì)量濃度/mg/mL；V表示提取液總體積/mL；m為藜麥總質(zhì)量/g；1.3.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計 單因素試驗每次試驗準確稱取5 g過60目篩的粉碎藜麥粉（未萌芽），分別以乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度3個因素進行單因素試驗，以皂甙含量為衡量指標。（具體方案見表1）表1藜麥皂甙提取單因素試驗表因素水平乙醇體積分數(shù)/5060708090料液比/g:mL110120130140150提取溫度/2030405060 提取工藝的優(yōu)化根據(jù)單因素試驗結(jié)果，結(jié)合Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，確定了以乙醇體積分數(shù)、

13、料液比、提取溫度三個因素為自變量，皂甙提取量為響應(yīng)值，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析設(shè)計試驗，對高氯酸比色法測定藜麥皂甙條件進行優(yōu)化。（試驗因素與水平設(shè)計見表2）表2 響應(yīng)面分析因素與水平因素水平-101乙醇體積分數(shù)/607080料液比/g: mL120130140提取溫度/405060 萌芽藜麥的制備粗藜麥（未脫殼）過篩，除雜后選取飽滿完好的藜麥粒，用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡20 min后用去離子水沖洗23次24。然后將藜麥米平鋪于鋪有四層紗布的培芽箱上，噴曬去離子水，放入恒溫培芽箱于25 、間隔6 h淋水、間隔6 h臭氧殺菌條件下發(fā)芽。每隔6 h取樣一次，分別制得發(fā)芽6、12、

14、18、24、30、36、42、48，60、72、96、120、144 h的發(fā)芽藜麥。然后將收集的發(fā)芽藜麥于冰箱預(yù)凍待收集齊全后冷凍干燥，粉碎，過100目篩，得到發(fā)芽藜麥粉。2 結(jié)果與分析2.1 齊墩果酸標準曲線由圖1可知，齊墩果酸標準品在500600 nm處的最大吸收波長為560 nm，此結(jié)果與任卓偉等16的研究結(jié)果一致。因此，選用560 nm為檢測波長。圖1 齊墩果酸標準品不同波長的吸光度值圖2 齊墩果酸標準曲線以吸光度值為橫坐標（x），以齊墩果酸濃度/mg/mL為縱坐標（y）繪制標準曲線如圖2，并采用線性擬合求得標準方程為y=2.863 1x+0.011 2；相關(guān)系數(shù)：R2 =0.997

15、4，顯示在此范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系（圖2）。2.2 單因素試驗結(jié)果圖3 單因素試驗結(jié)果2.2.1 乙醇體積分數(shù)對提取藜麥總皂甙的影響大多數(shù)皂甙極性較大，多具有吸濕性，易溶于水、熱甲醇和乙醇，難溶于丙酮和乙醚。結(jié)合實驗室條件及安全性，故選擇乙醇為溶劑。從圖3可以看出，藜麥籽粒皂甙含量在一定范圍內(nèi)隨著乙醇體積分數(shù)的增加而增加，當乙醇體積分數(shù)為70%時，提取出的皂甙含量最大，為5.35 mg/g。之后隨體積分數(shù)的增大含量反而減少，可能是因為當乙醇體積較大時，抑制了溶劑向物料的滲透，影響了皂甙的浸出，導致藜麥籽粒皂甙不能很好的提取出來13。因此選擇70%的乙醇為藜麥籽粒總皂甙的最佳提取條件。2.2.2

16、 料液比對提取藜麥總皂甙的影響由圖3可知，當料液比為130時，提取的皂甙含量最大，為5.14 mg/g。當料液比合適時，提取皂甙的效果才是最佳。太低時，提取不充分；太高，雖能完全提取，但提取液浪費較多。因此，由單因素實驗結(jié)果顯示，藜麥皂甙提取的最佳料液比為130。2.2.3 提取溫度對提取藜麥總皂甙的影響從圖3可以看出，溫度從20 升高到50 ，提取出的皂甙含量先緩慢降低再勻速升高。5060 時的皂甙提取含量相差不大?？赡苁且驗闈穸壬呒铀倭巳苜|(zhì)的擴散及溶劑的滲透，從而使得提取含量的升高；而溫度過高時也加快了雜質(zhì)的溶出，從而與黎麥皂甙的溶出產(chǎn)生了競爭，影響了皂甙的溶出效果22?；趯嶒炇覘l件限

17、制及實驗安全性，故選用50 為最佳提取溫度。2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果2.3.1 響應(yīng)面提取藜麥皂甙模型及顯著性檢驗應(yīng)用Box-Behnken模型的中心組合試驗設(shè)計原理，根據(jù)單因素實驗結(jié)果進行三因素三水平的試驗設(shè)計，其中自變量為乙醇體積分數(shù)：70%；料液比：130；提取溫度：50 ，以總皂甙含量為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析，試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果序號A:乙醇濃度%B:料液比gmLC:提取溫度皂甙含量mg/g10005.192-1-104.2831-104.3340005.2850005.356-1015.371014.288-1105.190-114.55100115.

18、321101-14.8121104.64130005.2614-10-14.11510-14.55160-1-14.25170005.32在上述17個試驗中，有12組析因試驗，12個析因點為自變量在A、B、C所構(gòu)成的三維定點。以及5組中心零點試驗，用于估計試驗誤差。對表中的試驗結(jié)果進行多次擬合回歸分析，得到模型的二次多項回歸方程為：Y=5.28-0.12A+0.31B+0.22C-0.13AB-0.37AC+0.055BC-0.43A2-0.26B2-0.29C2其中對該模型進行方差分析，結(jié)果見表4表4 響應(yīng)面試驗結(jié)果的方差分析 變異來源平方和自由度均方F 值P值顯著性模型3.4590.381

19、10.85< 0.0001 A-乙醇體積0.1210.1234.690.0006 B-料液比0.7510.75216.81< 0.0001 C-溫度0.3810.38110.62< 0.0001 AB0.0710.0718.790.0034 AC0.5410.54156.1< 0.0001 BC0.0110.013.50.1037 A20.7910.79227.58< 0.0001 B20.2810.2882.25< 0.0001 C20.3510.35102.32< 0.0001殘差0.0273.46E-03失擬項0.0133.08E-030.820

20、.5467純誤差0.0243.75E-03總和3.4816R20.993 調(diào)整R20.9841由方差分析表4可看出，本試驗選用模型 P<0.0001，表明模型達到極顯著；失擬項P0.5467 >0.05，表明失擬不顯著；相關(guān)系數(shù)R2=0.993；信噪比26.957，遠大于4，這說明該回歸方程的擬合度和可信度均很高。因此，此模型可用于預(yù)測高氯酸法測藜麥皂甙及工藝優(yōu)化。由方差分析表中對回歸方程系數(shù)顯著檢測可知，藜麥皂甙提取的乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度的一次項、二次項，乙醇體積和料液比、乙醇體積和溫度的交互作用均達到極顯著水平（P<0.01），料液比和提取溫度的交互作用不顯著。

21、由回歸方程分析可知，影響藜麥皂甙提取的因素主次順序為：料液比（B）>提取溫度(C) >乙醇體積分數(shù)(A)。2.3.2 響應(yīng)面分析及最佳條件確定響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各因素所構(gòu)成的三維空間曲面圖，在方差分析的基礎(chǔ)上，利用Design Expert 繪制交互項乙醇體積分數(shù)，料液比，提取溫度交互作用的曲面圖和等高線圖，如圖4，圖5，圖6所示：圖4 Y=f(A,B)響應(yīng)面與等高線圖圖5 Y=f(A,C)響應(yīng)面與等高線圖圖6 Y=f(B,C)響應(yīng)面與等高線圖由于等高線的形狀可以反映交互項的強弱，等高線圖呈橢圓形表示兩者交互作用顯著，圓形則與之相反。由圖6的響應(yīng)面等高線圖可以看出，圖6呈現(xiàn)出的形

22、狀沒有其它圖的明顯。結(jié)合方差分析表的數(shù)據(jù)，因素間的交互作用對提取率的影響效果為：AC>AB >BC表5 萌芽藜麥皂甙含量萌芽時間h皂甙含量mg/g百分含量05.560.5663.600.36123.500.35183.600.36243.410.34303.370.34363.410.34423.120.31483.410.34604.460.45726.750.68967.800.781207.800.781447.130.71通過Design Expert軟件對非線性回歸模型進行求解，得出最優(yōu)的因素水平分別為：乙醇體積分數(shù)63.74%，料液比138.33 g/mL，提取溫度58

23、.52 ，在此條件下皂甙含量預(yù)測值為5.54 mg/g。由于操作可行性，將最佳條件修正為：乙醇體積分數(shù)65%，料液比140 g/mL，提取溫度60 。在此條件下進行三次平行驗證試驗，測得藜麥皂甙含量均值為5.56 mg/g，結(jié)果與預(yù)測值相近。2.4 萌芽藜麥皂甙含量測定經(jīng)過單因素試驗及響應(yīng)面優(yōu)化試驗，得到修正的藜麥皂甙最佳制備條件為：乙醇體積分數(shù)65%，料液比140 g/mL，提取溫度60 。在此條件下測得萌芽藜麥皂甙含量，結(jié)果如表5：圖7 萌芽藜麥皂甙含量從圖7可看出，萌芽6 h內(nèi)的藜麥皂甙含量極速下降。藜麥籽粒皂甙80%集中于種皮7，且藜麥屬于易發(fā)芽的種子25。在萌芽初期，種皮吸水膨脹掉落

24、，皂甙隨淋水而流走，從而導致皂甙含量的驟降。之后在642 h之間，皂甙含量變化不大，保持3.5 mg/g上下小幅度浮動。從42 h開始，皂甙含量逐漸升高，4872 h期間萌芽藜麥皂甙含量增長速度高于7296 h。王莘等26對萌芽期綠豆功能性營養(yǎng)成分的研究發(fā)現(xiàn)，萌芽39 h后，異黃酮和皂甙含量出現(xiàn)最大值，分別增加54.8%和138%。萌芽96 h后，藜麥皂甙含量出現(xiàn)緩慢下降趨勢。萌芽后期，皂甙含量增加的原因及機理，目前還沒有相關(guān)報道。據(jù)PawelPasko等27對萌芽藜麥抗氧化性的研究表明，萌芽藜麥抗氧化活性的明顯增高是因為萌芽過程使多酚、花青素及其他未知成分含量的增加。L.Alvarea-J等

25、28認為萌芽過程中某些內(nèi)源性水解酶的產(chǎn)生及其活性的增加導致萌芽期間抗氧化活性增加。3 結(jié)論本試驗采用響應(yīng)面法對藜麥籽粒中皂苷的提取條件進行探索，得出最佳調(diào)提取條件為: 乙醇體積分數(shù)65%，料液比140 g/mL，提取溫度60 。影響藜麥皂甙提取的因素主次順序為：料液比（B）>提取溫度(C) >乙醇體積分數(shù)(A)。在此條件下，觀察萌芽144 h的藜麥皂甙含量的變化，發(fā)現(xiàn)萌芽初期（6 h內(nèi)）皂甙含量較未萌芽狀態(tài)下降了約40%，642 h保持約3.5 mg/g，42 h后開始增加直至96 h時達最高值0.78 mg/g。萌芽后期（120 h后）皂甙含量緩慢減少。至于皂甙含量增加的原因及機

26、理、萌芽藜麥抗氧化活性的增高是否與皂甙含量的增加有關(guān)待進一步的研究。參考文獻1Dini I,Tenore G C, Dini A. Antioxidantcompound contents and antioxidant activities before and after cooking in sweet and bitter Chenopodium quinoa seedsJ. Food Science and Technology,2010,43:4474512Han X,Shen T,Lou H. Dietary polyphenols and their biological si

27、gnificance J.International Journal of Molecular Sciences,2007,8: 9509883Jacobsen S E. The worldwide potential for quinoa ( Chenopodium quinoa Wild.) potential J. Food Reviews International,2003,19:167-1774Atul B,Sudhir S,Deepak O. Chenopodium quinoa An International perspective J.Industrial Crops an

28、d Products,2006,23:73-875Stikic R,Glamoclija D,Demin M, et al. Agronomical and nutritional evaluation of quinoa seed (Chenopodium quinoa Wild) as an ingredient in bread formulations J. Journal of Cereal Science,2012, 55:132-1386FAO.Quinoa: An ancient crop to contribute to world food securityEB/OL.Sa

29、ntiago,FAO Regional Office for Latin American and the Caribbean2011/alc/file/media/pubs/2011/cultivo_quinoa_en.pdf7 FAO. Home-international year of quinoa 2013EB/OL 2014-2-21./quinoa-2013/en/8Estrada A, Li B, Laarryeld B.Adjuvant action of Chenopodium quinoa saponin

30、s on the induction of antibody responses to intragastric and intranasal administered antigens in mice J. Comp Immunolmicrobiolinfect dis,1998,21(3):225-2369Ozlem G,Gluseppe M. Saponins: properties, applications and processingJ. Food Science and Nutrition,2007,47: 231- 25810Ma W W,Heinstein P,Mclaugh

31、lin J, et al. Additional toxic,bittersaponins from the seeds of Chenopodium quinoaJ.Journal of Natural Products,1989,52(5):1132-113511Abdou A M, Abdallah H M, Mohamed MA, et al. A new anti-inflammatory triterpenesaponin isolated from Anabasis setiferaJ. Archives of Pharmacalresearch,2013:1-812Mar

32、37;a E,Carmen R R,Sebastián S J, et al. Surfactant and antioxidant properties of an extract from Chenopodium quinoa Willd seed coat J. Journal of Cereal Science, 2011,53:239- 243.13Brittany L G,Alexander P,Peter K,et al. Quinoa seeds leach phytoecdysteroids and other compounds with anti- diabet

33、ic propertiesJ. Food Chemistry,2014,163:178- 185.14Meyer B N,Heinstein P F,Burnouf R M,et al. Bioactivity-directed isolation and characterization of quinoside A: one of the toxic/bitter principles of quinoa seeds (Chenopodium quinoa Willd.)J. Agriculture Food Chemistry,1990,38:205-208 15Ana M G C ,G

34、invanna I,Vito V,et al.Influence of pearling process on phenolic and saponin content in quinoa(Chenopodium quinoa Wild)J.Food Chemistry. 2014,(157):174-1716任卓偉,倪文杰,劉森.藜麥皂甙的測定研究J.山西農(nóng)業(yè)科學，2015,43(8):932-935Ren Z W, Ni W J, Liu S. Determination of Quinoa Saponins J. Journal of Shanxi Agriculture Science

35、,2015,43(8):932-93517Rimsten L, Haradsson A K, Andesson R, et al. Effects of malting on ß-glucanase and phytase activity in barley grain J.Journal of the Science and FoodAgriculture,2002,82(8):904-912 18Yang T K, Basu B O, Oraikul F. Studies on germination conditions and antioxidant contents of

36、 wheat grain J .International Journal of Science and Nutrition, 2001,52(4):319-330.19Kuljanabhagavad T, Thongphasuk P, ChamulitratW,et al. Triterpenesaponins from Chenopodium quinoa WildJ.Phytochemistry, 2008,69(9):1919-192620Ren S, Sun J. Changes in phenolic content, phenylalanine ammonia-lyase (PA

37、L) activity and antioxidant capacity of two buckwheat sprouts in relation to germination J .Journal of Functional Foods, 2014,7:298-30421Chavan J K, Kadam S S, Beuchat LR. Nutritional improvement of cereals by sprouting J. Critical reviews in Food Science & Nutrition, 1989,28(5):401-43722趙文婷.藜麥麩皮總皂甙的提取純化及其抗氧化和免疫增強作用D.山西：山西農(nóng)業(yè)大學,2015Zhao W T. The extraction, purification, antioxidant and immunoenhancement in Chenopodium Quinoa Wild bran total saponins D. Shanxi: Shanxi Agriculture University,201523杜靜婷,陳超,范三紅.響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥糠皂苷的提取及抗氧化活性J. 山西農(nóng)業(yè)科學,2016,44(7):932-937Du J T, Chen C, Fan S