血安片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

1、血安片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究                作者：冮海峰 胡躍蘭 孟祥軍【摘要】  目的：按新藥審批標(biāo)準(zhǔn)為血安片制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：以TLC法對(duì)血安片中棕櫚子進(jìn)行定性鑒別；以HPLC法測(cè)定血安片中沒食子酸的含量。結(jié)果：試驗(yàn)采用薄層色譜法定性鑒別，色譜斑點(diǎn)清晰，分離度良好，陰性液無干擾；以HPLC法測(cè)定該片劑中沒食子酸的含量，方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，回收率為97.28103.22%，&

2、#160;RSD為2.0%(n=9)。結(jié)論：本試驗(yàn)所確定的質(zhì)量分析方法穩(wěn)定可靠，能作為本片劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。 【關(guān)鍵詞】  血安片 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 方法學(xué)研究    【Abstract】Object:formulate the quality standard for the Xue,an tablets according to the requirement by Evaluat

3、ion of Chinese Government。Methods:the qualitative identifying method by TLC was established for Zonglvzi and gallic acid was quantitatively determined by HPLC。Result shows:the spots on&

4、#160;the TLC are clear by the methods of qualitative identification by TLC,the resolution is well and have no negative sample interference。The method for determinating the con

5、tent of tablets by HPLC is suitable for the formulate of the quality standard with sufficient accuracy、stability and reappearance 。The recovery rate is 97.28 103.22 %,RSD 

6、;is 1.92% (n=9)。Conclusion:the qualitative and quantitative analytic methods are stable and reliable。    【Keyword】The Xue,an tablets   Quality Standard   Method Appraise 

7、   血安片是根據(jù)已有部頒標(biāo)準(zhǔn)的血安膠囊1改變劑型得到的中成藥制劑。是由棕櫚科植物棕櫚子的干燥成熟果實(shí)經(jīng)乙醇提取加工制成的片劑，屬中藥八類新藥。本品應(yīng)用于臨床上具有止血、收斂、調(diào)經(jīng)之功效，用于治療月事不準(zhǔn)、經(jīng)血過量、崩漏、淋漓不止、產(chǎn)后惡露不盡等婦科出血癥。為保證臨床用藥安全有效，嚴(yán)格控制此片劑的質(zhì)量，特對(duì)處方中棕櫚子2的定性、定量方法加以篩選和分析，從而確立穩(wěn)定可靠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。    原血安膠囊標(biāo)準(zhǔn)1鑒別項(xiàng)下為顯色反應(yīng)，為TLC薄層鑒別。通過實(shí)驗(yàn)證明，鑒別現(xiàn)象明顯，具有重現(xiàn)性，可以繼續(xù)沿用。而對(duì)鑒別項(xiàng)進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果表明，此

8、標(biāo)準(zhǔn)鑒別項(xiàng)下的薄層條件未能使棕櫚子中的原兒茶酸達(dá)到有效的分離。通過查閱相關(guān)資料，我們采用文獻(xiàn)“復(fù)方丹參口服液中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”3中的鑒別項(xiàng)的展開劑條件對(duì)本品的鑒別項(xiàng)進(jìn)行了試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果證明此展開劑能夠滿足原兒茶酸的分離要求，且棕櫚子中的原兒茶醛在此條件下也能顯色，但與其他組分的分離效果并不理想，所以我們對(duì)此展開劑進(jìn)行了優(yōu)化，將展開劑苯-醋酸乙酯-甲酸（80504）的比例更改為（70404），此條件可以使原兒茶酸、原兒茶醛同其他組分有效的分離，所以特增加了棕櫚子中原兒茶醛的鑒別，顯色現(xiàn)象明顯。經(jīng)上述試驗(yàn)，修訂了棕櫚子的薄層鑒別。    我們參照文獻(xiàn)“復(fù)方珍珠口

9、瘡顆粒中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”4中沒食子酸含量測(cè)定法對(duì)本品中所含的沒食子酸進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，沒食子酸峰與其他雜質(zhì)峰能夠有效分離，其方法能夠滿足控制本品含量的要求，故我們采用文獻(xiàn)中的HPLC法，建立了高效液相色譜條件，測(cè)定制劑中沒食子酸的含量，其方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)。同時(shí)考慮到本品中沒食子酸含量，我們將對(duì)照品與供試品的取樣量進(jìn)行了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。    1  實(shí)驗(yàn)資料    1.1  處方  棕櫚子10000g。    1

10、.2  制法  將棕櫚子粉碎成粗粉，用5倍量的95%乙醇浸泡20分鐘，加熱提取2小時(shí)，回收乙醇，濾過，濾液濃縮至相對(duì)密度1.201.22（60）的清膏，干燥，粉碎成細(xì)粉，加入適量的輔料，混勻，制成顆粒，干燥，壓制成素片1000片，包薄膜衣，即得。    2  性狀    本品為暗紅色薄膜衣片；除去包衣后顯棕紅色，味澀。    3  薄層定性鑒別    本制劑

11、是由棕櫚子經(jīng)乙醇提取加工制成的薄膜衣片，片重0.55g，其中含原藥粉0.5g，相當(dāng)于原藥材10g。除去包衣后顯棕紅色，味澀。本品化學(xué)成分明確，對(duì)具有的對(duì)照品重點(diǎn)進(jìn)行了篩選，最后確立采用TLC法對(duì)棕櫚子中原兒茶酸、原兒茶醛進(jìn)行定性鑒別，試驗(yàn)條件與方法說明如下。    3.1  展開劑的選擇    本實(shí)驗(yàn)先后采用氯仿-丙酮-甲醇-冰醋酸（7110.5）2（），氯仿-甲醇-水（1371）5（），氯仿-丙酮-甲醇-冰醋酸（720.50.5）6 （），苯-醋酸乙酯-甲酸（80504）3（）為展開

12、劑，在系統(tǒng)（）的條件下，供試溶液中原兒茶酸與相鄰組分分離度良好，并分離出了原兒茶醛，但分離效果不明顯。為了更好的達(dá)到分離的目的，對(duì)其展開劑比例進(jìn)行了一定的調(diào)整，經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，苯-醋酸乙酯-甲酸（70404）的比例效果最優(yōu)。本試驗(yàn)曾對(duì)苯進(jìn)行了環(huán)己烷、正己烷等化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的試劑的替代試驗(yàn)，但實(shí)驗(yàn)效果不佳，故確立苯-醋酸乙酯-甲酸（70404）為展開劑，鑒別其成分原兒茶酸、原兒茶醛。    3.2  棕櫚子的TLC法鑒別    儀器：薄層層析裝置、烘箱。試劑：所用試劑為分析純，薄層層析用硅膠G由青島海

13、洋化工有限公司制造，為化學(xué)純。薄層板：取硅膠G，按13比例加入水，鋪成0.3mm厚的薄層板，晾干，105活化30分鐘，干燥箱內(nèi)保存。    本試驗(yàn)根據(jù)復(fù)方丹參口服溶液中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：WS-150（Z-30）-92規(guī)定的方法檢查方中棕櫚子所含的原兒茶酸、原兒茶醛，經(jīng)采用萃取法去除了部分干擾組分的影響，經(jīng)多次試驗(yàn)，供試品色譜中，具有與對(duì)照品相同位置的相同顏色的斑點(diǎn)，待測(cè)組分斑點(diǎn)清晰，方法重復(fù)性良好，陰性液無干擾。    供試品及標(biāo)準(zhǔn)品的制備按照血安片標(biāo)準(zhǔn)，考慮到原膠囊內(nèi)容物中未添加輔料，故標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)根據(jù)藥物原粉與輔料的

14、比例適當(dāng)增加供試品的取樣量。具體操作方法：取本品12片，研細(xì)，取約5.5g，加水50ml，熱浸2小時(shí)，濾過，濾液置分液漏斗中，用乙醚提取二次，每次20ml，合并乙醚層，蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。另取原兒茶酸、原兒茶醛對(duì)照品，分別加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2005年版一部附錄 B）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各20l，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-甲酸（70404）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)久置加深。  

15、;  4  檢查    照中國(guó)藥典2005年版一部（附錄D）7檢查。    4.1  重量差異  照中國(guó)藥典2005年版一部附錄D的重量差異項(xiàng)下測(cè)定，重量差異限度應(yīng)在標(biāo)示裝量的±5.0%以內(nèi)，三批樣品均符合規(guī)定，結(jié)果見表1。表1    重量差異的測(cè)定結(jié)果結(jié)果表明，三批樣品重量差異均符合規(guī)定。    4.2  崩解時(shí)限 

16、 照崩解時(shí)限檢查法（中國(guó)藥典2000年版一部附錄 A）測(cè)定樣品，三批樣品（20060304、20060305、20060306）的檢查結(jié)果見表2。表2  崩解時(shí)限的檢查結(jié)果結(jié)果表明，三批樣品崩解時(shí)限均符合規(guī)定。    4.3  微生物限度  照微生物限度檢查法（中國(guó)藥典2005年版一部附錄 C），細(xì)菌數(shù)限度為100個(gè)/g，霉菌、酵母菌數(shù)限度為100個(gè)/g，大腸桿菌、活螨不得檢出。三批供試品（20060304、20060305、20060306）的檢驗(yàn)結(jié)果，測(cè)定結(jié)果見

17、表3。表3  微生物限度檢查結(jié)果結(jié)果表明，三批樣品微生物限度檢查均符合規(guī)定。    4.4  砷鹽  按砷鹽檢查法（中國(guó)藥典2005年版一部附錄 F）試驗(yàn)。    精密量取每1ml含1g的標(biāo)準(zhǔn)砷溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml，置坩堝中，同供試品砷斑制備方法，依法制備標(biāo)準(zhǔn)確砷斑（依次為A、B、C）；取本品10片，研細(xì)，取約1g，精密稱定，置坩堝中，緩緩灼燒至完全炭化，放冷，加硫酸1ml使?jié)駶?rùn)，用低溫加熱至硫酸除盡后，加硝酸0.5ml，蒸干，

18、至氧化氮蒸氣除盡，放冷，在540灼燒使完全炭化，放冷，加水25ml，定量轉(zhuǎn)移至A瓶中，加碘化鉀試液5ml與酸性氯化亞硒試液5滴，在室溫放置10分鐘后，加鋅片2g，立即連接導(dǎo)氣管C與A瓶，置37水浴中，反應(yīng)45分鐘，取出溴化汞試紙，即得。依法測(cè)定三批樣品（20060304、20060305、20060306），砷鹽含量均低于2ppm，測(cè)定結(jié)果見表4。表4     砷鹽檢查結(jié)果試驗(yàn)結(jié)論：通過對(duì)三批樣品的檢驗(yàn)其砷鹽含量均低于2ppm，因此暫不將其列入標(biāo)準(zhǔn)。    4.5  熾灼殘?jiān)?#160

19、; 按熾灼殘?jiān)鼨z查法（中國(guó)藥典2005年版一部附錄 J）測(cè)定。取本品10片，研細(xì)，取約1g，置已熾灼至恒重的坩堝中，精密稱定，緩緩熾灼至完全炭化，放冷至室溫，加硫酸1ml，使?jié)駶?rùn)，低溫加熱至硫酸蒸汽除盡后，在540熾灼使完全灰化，移置干燥器內(nèi)，放冷至室溫，精密稱定后再在540熾灼至恒重。測(cè)定三批供試品（20060304、20060305、20060306），熾灼殘?jiān)烤陀?.2%，測(cè)定結(jié)果見表5。表5  熾灼殘?jiān)臏y(cè)定結(jié)果試驗(yàn)結(jié)論：通過對(duì)三批樣品的檢驗(yàn)熾灼殘?jiān)烤陀?.2%，因此暫不將其列入標(biāo)準(zhǔn)。    4

20、.6  重金屬  按重金屬檢查法（中國(guó)藥典2005年版一部附錄 E第二法）測(cè)定。取熾灼殘?jiān)?xiàng)下殘?jiān)?，分別加硝酸0.5ml，蒸干，至氧化氮蒸汽除盡，放冷，加鹽酸2ml，置水浴上蒸干后加水15ml，滴加氨試液至對(duì)酚酞指示液顯中性，再加醋酸鹽緩沖液（PH=3.5）2ml，微熱使溶解，移置納氏比色管中，加水稀釋成25ml（乙管：1、2、3）；另取配制供試品溶液的試劑，共四份，分別置瓷皿中蒸干，各加醋酸鹽緩沖液（PH=3.5）2ml與水15ml，微熱使溶解，分別移置納氏比色管中，分別加每1ml相當(dāng)于10g的標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2

21、.0ml，加水稀釋成25ml（甲管：1、2、3與4）。在甲乙兩組管中，加硫代乙酰胺試液各2ml，搖勻，放置2分鐘，同置白紙上，自上而下透視，比較甲管與乙管的顏色。結(jié)果：乙管1、2、3的顏色均比甲管2的顏色淺。三批供試品（20060304、20060305、20060306）中重金屬含量均低于10ppm，測(cè)定結(jié)果見表6。表6   重金屬測(cè)定結(jié)果試驗(yàn)結(jié)論：通過對(duì)三批樣品的檢驗(yàn)重金屬含量均低于10ppm，因此暫不將其列入標(biāo)準(zhǔn)。    5  含量測(cè)定    本制劑由棕櫚子經(jīng)

22、提取加工制成，經(jīng)參考有關(guān)文獻(xiàn)表明棕櫚子中含有原兒茶酸、原兒茶醛、對(duì)羥基苯甲酸、d-兒茶素、沒食子酸等?，F(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，沒食子酸為棕櫚子中主要的止血成分，具有抗凝血和血栓形成等生理活性，故本試驗(yàn)擬HPLC法測(cè)定沒食子酸的含量，對(duì)控制本品的內(nèi)在質(zhì)量很有意義。在選定的色譜條件下，陰性液無干擾。經(jīng)方法學(xué)考察，方法的線性、精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、最低檢測(cè)限、定量限、陰性對(duì)照溶液試驗(yàn)、加樣回收試驗(yàn)、樣品的含量測(cè)定均符合有關(guān)規(guī)定。因此，確立本制劑定量指標(biāo)為沒食子酸，定量方法為液相色譜法。    5.1  儀器試藥  

23、0; 儀器：高效液相色譜儀（UV200 大連依利特科學(xué)儀器有限公司）；SunRun Express色譜數(shù)據(jù)工作站；電子天平（AL204 梅特勒-托利多上海稱重設(shè)備公司）；色譜柱：Diamonsil C18柱（205×4.6mm，5m）；試藥：甲醇-0.1%磷酸水溶液（1585），甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，沒食子酸（供含量測(cè)定用，110831-200302），中國(guó)藥品生物制品檢定所。    5.2  色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)考察   

24、0;5.3  線性范圍考察     精密稱取沒食子酸對(duì)照品12mg置100ml量瓶中，加20%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻。再分別精密量取0.8、0.9、1.0、1.1、1.2ml，置10ml量瓶中，加20%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1ml分別含9.6g、10.8g 、12g 、13.2g 、14.4g沒食子酸的溶液。精密量取上述溶液各20l，分別注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，結(jié)果見表8。以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣濃度（，g/ml）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=99483x17969，相關(guān)系數(shù)R2=0.

25、9997。結(jié)果表明，注入液相色譜中的沒食子酸質(zhì)量在0.1920.288g范圍內(nèi)，峰面積與沒食子酸濃度線性關(guān)系良好。分別精密吸取上述溶液各20l，注入液相色譜儀中，測(cè)定色譜峰面積，測(cè)定結(jié)果見表7。表7    線性范圍考察結(jié)果以注入液相色譜中的沒食子酸的量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)線性回歸，回歸方程為：Y=5E06x17969，R2=0.9997，由測(cè)定結(jié)果提示，注入液相色譜中的沒食子酸質(zhì)量在0.1920.288g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。    5.4  陰性干擾試驗(yàn) &#

26、160;  5.5  供試品溶液制備方法考察    鑒于本制劑中棕櫚子已經(jīng)提取后加入，故本試驗(yàn)擬以超聲處理法制備供試液。試驗(yàn)中對(duì)提取溶劑、超聲處理?xiàng)l件進(jìn)行了定量考察，考察結(jié)果如下。    5.6  精密度試驗(yàn)考察    5.7  穩(wěn)定性試驗(yàn)考察    取本品5片（批號(hào)20060304）去包衣后研細(xì)，取細(xì)粉約1.3g，精密稱定，按正文含量測(cè)定項(xiàng)下方法制備供試液

27、。精密量取同一供試液（批號(hào)20060304）20l，按0、2、4、6、8小時(shí)時(shí)間間隔，分別進(jìn)樣分析，測(cè)定色譜峰面積，測(cè)定結(jié)果見表12。表12  穩(wěn)定性試驗(yàn)考察結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果提示，供試液制備后8小時(shí)內(nèi)測(cè)定，色譜峰面積無明顯變化，在此時(shí)間內(nèi)待測(cè)組分化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。    5.8  最低檢測(cè)限    取對(duì)照品溶液1ml，置100ml量瓶中，加20%甲醇稀釋至刻度，搖勻，再精密量取20l注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，按3倍信噪比S/N計(jì)，最低檢測(cè)限為2.4ng。  &

28、#160; 5.9  定量限    取對(duì)照品溶液3ml，置100ml量瓶中，加20%甲醇稀釋至刻度，搖勻，再精密量取20l注入液相色譜儀中，記錄色譜圖。色譜圖中，信噪比約為101，計(jì)算定量限約為7.2ng。    5.10  加樣回收試驗(yàn)考察    取沒食子酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含12g的溶液，即得，作為對(duì)照品溶液。取本品5片，去包衣后研細(xì)，取細(xì)粉約1.3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇15ml，稱

29、重，超聲處理（功率200W，頻率40KHz）30分鐘，取出，放冷，稱重（補(bǔ)足原重量），搖勻，濾過，濾液經(jīng)微孔濾膜（0.45m）濾過，溶液置棕色瓶中備用，即得，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液與對(duì)照品溶液各20l，分別注入液相色譜儀，測(cè)定，測(cè)得供試品中沒食子酸的含量（C）為140.8g/g。取沒食子酸12mg，置100ml容量瓶中，加20%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻；再精密量取10ml，置100ml容量瓶中，加20%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1ml含沒食子酸12g，作為加樣用對(duì)照品溶液。取上述已經(jīng)測(cè)定含量的供試品藥粉，分別精密稱定約0.9g、1.3g、1.7g各三份，精密稱定，置具

30、塞錐形瓶中，精密加甲醇、加樣用對(duì)照品溶液各15ml，稱重，超聲處理（功率200W，頻率40KHz）30分鐘，取出，放冷，稱重（補(bǔ)足原重量），搖勻，濾過，濾液經(jīng)微孔濾膜（0.45m）濾過，溶液置棕色瓶中備用，即得，作為加樣用供試品溶液。精密量取上述各溶液20l，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率，測(cè)得9次平均回收率為99.80%，RSD為2.0%，結(jié)果見表13。測(cè)得量（mg）=A供/A對(duì)×C對(duì)×30（ml），樣品中沒食子酸含量（g）=供試品取樣量×140.8（g/g）。表13      &

31、#160;     加樣回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果測(cè)定結(jié)果提示：本方法回收率在97.28103.22%之間，RSD為2.0%，符合有關(guān)規(guī)定。        根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，制定血安片的含量測(cè)定方法如下。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.1%磷酸水溶液（1585）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為273nm。理論板數(shù)按沒食子酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。對(duì)照品溶液的制備：取沒食子酸對(duì)照品適量，精密稱定，加20%甲醇制成每1ml含12g的溶液，即得。供試品溶液

32、的制備：取本品5片，去包衣后研細(xì)，取細(xì)粉約1.3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇15ml，稱重，超聲處理（功率200W，頻率40KHz）30分鐘，取出，放冷，稱重（補(bǔ)足原重量），搖勻，濾過，濾液經(jīng)微孔濾膜（0.45m）濾過，溶液置棕色瓶中備用，即得。測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20l，注入液相色譜儀，即得。    5.11  含量限度確定的試驗(yàn)    為制定含量限度標(biāo)準(zhǔn)，制備供試品十批（20060301、20060302、20060303、20060304、2006030

33、5、20060306、20060307、20060308、20060309、20060310），并與血安膠囊市售品（批號(hào)20060227）比較。按上述測(cè)定方法，測(cè)定樣品中沒食子酸的含量，結(jié)果見表14。表14    樣品的測(cè)定結(jié)果本品的原藥材棕櫚子收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥材第一冊(cè)（1992年版），其中沒有對(duì)其有效成分沒食子酸進(jìn)行限量，而且查閱相關(guān)文獻(xiàn)仍沒有明確的規(guī)定。因此根據(jù)上述測(cè)定結(jié)果，考慮到藥材的來源和質(zhì)量差異對(duì)棕櫚子回收率的影響，最后將其含量限度暫定為：本品每片含棕櫚子以沒食子酸（C7H6O5）計(jì)，不得少于50g。    6  討論    6.1  本試驗(yàn)采用T