VEGF 936CT基因多態(tài)性與進(jìn)展性卒中相關(guān)性的研究

1、VEGF 936C/T基因多態(tài)性與進(jìn)展性卒中相關(guān)性的研究【摘要】目的討論VEGF936/T多態(tài)性與進(jìn)展性卒中的相關(guān)性。方法經(jīng)臨床確診的腦梗死患者200例，分成普通腦梗死組134例和進(jìn)展性卒中組66例，另選年齡、性別相匹配的安康對(duì)照組100例。應(yīng)用RFLP方法對(duì)所有受檢者的VEGF基因型進(jìn)展鑒定；分析VEGF936/T基因多態(tài)性與進(jìn)展性卒中的相關(guān)性。結(jié)果進(jìn)展性卒中組936T等位基因的攜帶頻率高于安康對(duì)照組，VEGF936T與進(jìn)展性卒中有相關(guān)性R：1.882；95%可信區(qū)間1.2692.789；而普通腦梗死組936T等位基因的攜帶頻率與安康對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論攜帶936T等位基因可增加患者

2、腦梗死進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)性，而936可降低腦梗死進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)性?！娟P(guān)鍵詞】進(jìn)展性卒中VEGF936/T單核苷酸多態(tài)性rrelativestudyn936/TgeneplyrphisfvasularendthelialgrthfatrVEGFandadvaningstrkeAbstratbjetiveTinvestigatetheassiatinbeteen936/TgeneplyrphisfvasularendthelialgrthfatrVEGFandstrkeinprgressinrisk.ethdsUsingtheethdfrestritivefragentlengthplyrphisRFLP,t

3、heVEGFgentypesf66strkeinprgressinpatients,134pletedstrkepatientsand100healthyntrlsubjetseredeteted.TheassiatinbeteenVEGF936/Tgeneplyrphisandstrkeinprgressinaspared.ResultsThefrequenyfVEGFarrEiersith936T-allele936T+936TTinprgressinstrkepatientsassignifiantlyhigherthanthatinntrlgrup,hilethefrequenyfVE

4、GF936Talleleinpletedstrkeassiilariththatinntrlgrup.ThereaspsitiveassiatinbeteenVEGF936TandstrkeinprgressinR1.882;95%I1.2692.789.nlusinVEGF936T-alleleanraisetheriskfstkeevlutinhileVEGF936andereasetheriskfstrkeinprgressin.Keyrdsadvaningstrke;VEGF936/T;singlenuletideplyrphiss進(jìn)展性卒中strkeinprgressin,SIP是指

5、卒中發(fā)病后神經(jīng)功能缺失病癥在48h內(nèi)逐漸進(jìn)展或呈階梯式加重。其發(fā)病率為卒中患者的30%，致殘率和致死率較一般卒中高，是影響病人預(yù)后的重要原因之一，也是腦血管病治療中的難點(diǎn)。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的危險(xiǎn)因素有高血壓并糖尿并感染、人皰疹病毒感染和腦血管狹窄等。盡管我們對(duì)以上危險(xiǎn)因素進(jìn)展了積極的防治，仍有一部分患者會(huì)進(jìn)展。說(shuō)明進(jìn)展性卒中的病因仍沒(méi)有完全說(shuō)明。遺傳、多基因、多態(tài)性這三個(gè)方面是進(jìn)展性卒中研究的熱點(diǎn)。應(yīng)用單核苷酸多態(tài)性進(jìn)展遺傳性相關(guān)性研究，可以為腦卒中進(jìn)展的危險(xiǎn)性提供預(yù)示作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子vasularendthelialgrthfatr,VEGF因其可以增加血管通透性，誘導(dǎo)血管新生，促進(jìn)缺血

6、部位側(cè)支循環(huán)的建立，使其成為目前缺血性疾病研究的熱點(diǎn)之一。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和缺血半暗帶細(xì)胞的壞死是進(jìn)展性卒中的發(fā)病機(jī)制。然而，發(fā)生在VEGF基因3端非轉(zhuǎn)錄區(qū)936位點(diǎn)的常見(jiàn)突變，即-T易位，其中，VEGF936T據(jù)報(bào)道與VEGF的低血漿程度顯著相關(guān)1。國(guó)內(nèi)外有研究證實(shí)，VEGF936T與乳腺癌2、糖尿病腎病等的發(fā)生親密相關(guān)?；谏鲜?，我們推測(cè)VEGF936/T多態(tài)性與進(jìn)展性卒中相關(guān)。現(xiàn)討論VEGF936T與進(jìn)展性卒中的相關(guān)性如下。1對(duì)象與方法1.1研究對(duì)象2022年1月2022年1月期間哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院神經(jīng)內(nèi)科病房的住院患者200例，男107例，女93例，年齡3575歲，平均6210

7、.3歲，排除其他腫瘤性疾玻按病變進(jìn)展情況分為普通腦梗死組134例和進(jìn)展性卒中組66例。對(duì)所有患者標(biāo)明有無(wú)進(jìn)展性卒中可能的危險(xiǎn)因素3糖尿并高血壓并感染、腦血管狹窄50%、高血脂、高尿酸、高纖維蛋白原，同時(shí)選取與病例組的性別和年齡相匹配的安康志愿者100例作為對(duì)照組。所有研究對(duì)象均為東北漢族人。1.2儀器與試劑人血基因組DNA提取試劑盒離心柱型由TIANGEN-QIAGEN提供；Taq酶、dNTP、10ladingbuffer、20bpDNAarker購(gòu)自Takara公司；NIa限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB；VEGF引物合成由美國(guó)ABI公司完成。1.3方法用RFLP法鑒定VEGF的基因型。抽取每位受檢者

8、空腹靜脈血3l,按照常規(guī)方法從白細(xì)胞中提取基因組DNA，4保存。PR引物參照文獻(xiàn)2設(shè)計(jì)并合成，正向引物：5-AAGGAAGAGGAGATTGG-3，反向引物：5-TATGTGGGTGGGTGTGTTAAG-3。PR反響體系50l,包括正向反向引物各1l、dNTP4l、模板DNA8l、Taq酶1l、ddH230l、lddingbuffer5l。PR反響條件：95預(yù)變性4in、95變性30s、60退火45s、72延伸45s、30個(gè)循環(huán)后、72再延伸5in。產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，為198bp。PR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NIaNeEnglandBilabs5u于37消化3h后，再經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電

9、泳鑒定VEGF基因型。2結(jié)果用RFLP法鑒定VEGF的基因型，其電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。VEGF936不被分解198bp,而VEGF936T被分解為兩段分別為114bp和84bp。糖尿并高血壓并感染、腦血管狹窄和VEGF936T攜帶者均是進(jìn)展性卒中的危險(xiǎn)因素。病例組和對(duì)照組的基因頻率分布均符合Hardy-einberg平衡，進(jìn)展性卒中組與普通腦梗死組基因型分布情況比擬見(jiàn)表1；進(jìn)展性卒中組與安康對(duì)照組基因型分布情況比擬見(jiàn)表2；普通腦梗死組與安康對(duì)照組基因型分布情況比擬見(jiàn)表3。說(shuō)明進(jìn)展性卒中組和普通腦梗死組的VEGF936/T基因型分布不同，不能認(rèn)為普通腦梗死組和安康對(duì)照組的VEGF936/T基因型分布一

10、樣。進(jìn)展性卒中組VEGF936T等位基因攜帶者的頻率為50%，顯著高于普通腦梗死組的31.3%，進(jìn)展性卒中的936T等位基因攜帶者的比值比R值為1.882，95%的可信區(qū)間為1.2692.789,見(jiàn)表4。說(shuō)明VEGF936T等位基因攜帶者與VEGF936純合子的患者相比卒中進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)性會(huì)增高1.882倍。表1進(jìn)展性卒中組和普通腦梗死組VEGF936基因型分布的比擬表2進(jìn)展性卒中組和安康對(duì)照組VEGF936基因型分布的比擬表3普通腦梗死組和安康對(duì)照組VEGF936基因型分布的比擬表4進(jìn)展性卒中VEGF936T有關(guān)參數(shù)的估計(jì)值3討論通過(guò)對(duì)VEGF3端非轉(zhuǎn)錄區(qū)936位點(diǎn)基因多態(tài)性在進(jìn)展性卒中組、普通

11、腦梗死組和安康對(duì)照組中的比擬，我們發(fā)現(xiàn)，936/T突變減少了VEGF的表達(dá)，VEGF936T與進(jìn)展性卒中相關(guān)。該結(jié)果顯示，VEGF基因多態(tài)性，至少在東北漢族人中，是進(jìn)展性卒中的主要遺傳危險(xiǎn)因子；然而，我們不能排除VEGF基因的其他一些至今未知的突變，以及另外一些基因的突變?cè)谶M(jìn)展性卒中的易感性危險(xiǎn)因素中起一定作用。VEGF可以增加血管通透性，誘導(dǎo)血管新生，同時(shí)，VEGF作為部分內(nèi)生性調(diào)節(jié)劑，可以保持內(nèi)皮細(xì)胞的完好性，維持內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能，從而防止觸發(fā)內(nèi)源性或外源性凝血途徑4。研究發(fā)現(xiàn)VEGF還可以增加絲氨酸蛋白酶、纖維蛋白溶解酶、尿激酶和組織型纖溶酶原的表達(dá)和活性，從而發(fā)揮抗血栓形成作用5。目

12、前國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道，VEGF對(duì)缺血腦細(xì)胞DNA損害與修復(fù)具有重要影響6，另有文獻(xiàn)報(bào)道，VEGF可誘導(dǎo)抗凋亡蛋白的表達(dá)，是內(nèi)皮細(xì)胞的一個(gè)生存因素。假如VEGF的量低于閾值，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞將因?yàn)閂EGF依賴的內(nèi)皮細(xì)胞生存過(guò)程的縮短而程序性死亡7。因此VEGF可以通過(guò)阻止血栓進(jìn)展、溶解已形成的血栓，建立側(cè)支循環(huán)、減緩細(xì)胞凋亡等方面來(lái)防止卒中的進(jìn)展。腦梗死時(shí)，缺氧可導(dǎo)致進(jìn)展性的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的喪失以及細(xì)胞外基質(zhì)和神經(jīng)元的壞死，這些細(xì)胞的壞死是通過(guò)凋亡發(fā)生的。在腦卒中的發(fā)生開(kāi)展中，多種潛在的遺傳危險(xiǎn)因素可能參與其發(fā)病機(jī)制。在進(jìn)展性卒中中，可能有VEGF的表達(dá)缺乏和經(jīng)VEGF受體2的信號(hào)傳達(dá)的缺

13、陷，源于內(nèi)皮細(xì)胞受體數(shù)量的下降，或者VEGF受體/蛋白激酶活性的缺陷。影響VEGF分泌的因素有很多，VEGF936T據(jù)報(bào)道與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的低血漿程度顯著相關(guān)。缺氧可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，加速半暗帶細(xì)胞的不可逆的壞死，而缺氧誘導(dǎo)的VEGF的表達(dá)的增高可延緩內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的形成，促進(jìn)腦梗死的恢復(fù)，當(dāng)缺氧對(duì)腦組織的損害作用與其誘導(dǎo)的VEGF高表達(dá)對(duì)腦組織的保護(hù)作用失衡時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致進(jìn)展性卒中的形成。由此我們推測(cè)，VEGF936T攜帶者由于VEGF分泌的相對(duì)缺乏而導(dǎo)致了卒中的進(jìn)展。VEGF936T等位基因者血漿低VEGF程度確實(shí)切機(jī)制至今未知。對(duì)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的分析說(shuō)明：VEGF936有一個(gè)潛在的AP-41ativatrprtEin4結(jié)合位點(diǎn)，而936T那么沒(méi)有，936位-T突變導(dǎo)致了AP-4的潛在結(jié)合位點(diǎn)喪失。AP-4是一個(gè)螺旋環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子。它通過(guò)結(jié)合于特殊的增強(qiáng)位點(diǎn)增強(qiáng)多種基因的轉(zhuǎn)錄。AP-4