抗蟲(chóng)棉對(duì)aybc、ayck和常規(guī)棉所的抗藥性研究

抗蟲(chóng)棉對(duì)aybc、ayck和常規(guī)棉所的抗藥性研究

生物適應(yīng)度是指在環(huán)境中生存并繼承后代的相對(duì)能力，通常包括生活能力和繁殖力。有研究表明,與敏感種群相比,抗性種群的幼蟲(chóng)發(fā)育歷期和成蟲(chóng)繁殖能力都有所下降,抗性個(gè)體這種適合度劣勢(shì)被稱作適合度代價(jià)(fitnesscost)。目前,許多報(bào)道都證實(shí)了適合度代價(jià)與Bt抗性相關(guān),主要表現(xiàn)在抗性個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖能力等生物學(xué)特性受到了不利的影響。本研究在室內(nèi)使用雙價(jià)棉、單價(jià)棉和非轉(zhuǎn)基因棉作為篩選材料對(duì)棉鈴蟲(chóng)室內(nèi)種群進(jìn)行了連續(xù)篩選,研究了轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉對(duì)不同種群棉鈴蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖等生物學(xué)特性的影響,比較分析了篩選種群間適合度參數(shù)間的差異,明確了3個(gè)棉鈴蟲(chóng)種群經(jīng)過(guò)連續(xù)26代的抗性篩選后適合度的變化趨勢(shì)。同時(shí),通過(guò)對(duì)雙價(jià)篩選種群與單價(jià)篩選種群的比較,明確了外源基因CpTI的導(dǎo)入對(duì)棉鈴蟲(chóng)抗性發(fā)展和種群適合度的影響。本研究旨在明確轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的抗性風(fēng)險(xiǎn)、抗性發(fā)展動(dòng)態(tài)和抗性機(jī)理,為棉鈴蟲(chóng)的抗性治理提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1選擇抗性棉鈴蟲(chóng)品種AYBC種群為室內(nèi)用轉(zhuǎn)雙價(jià)基因(Cry1Ac+CpTI)棉種子粉進(jìn)行連續(xù)抗性篩選16代的棉鈴蟲(chóng)種群;AYBT種群為室內(nèi)用轉(zhuǎn)Bt基因(Cry1Ac)棉種子粉進(jìn)行連續(xù)抗性篩選16代的棉鈴蟲(chóng)種群;AYCK種群為室內(nèi)用常規(guī)棉種子粉連續(xù)飼養(yǎng)16代的棉鈴蟲(chóng)對(duì)照種群。1.1.2轉(zhuǎn)創(chuàng)不同品種棉的棉、棉產(chǎn)品轉(zhuǎn)Cry1Ac+CpTI棉品種為中棉所41,轉(zhuǎn)Cry1Ac基因棉品種為中棉所44,常規(guī)棉品種為中棉所49,以上品種均由中棉所科貿(mào)公司提供。1.1.3bt蛛蛋白測(cè)定Cry1Ac毒素為Cry1Ac型BtICP20%的MVPⅡ水劑(Mycogen公司生產(chǎn));種子中Bt殺蟲(chóng)蛋白測(cè)定試劑盒為Envirologix公司的QualiplateTMKitforCry1Ab/Cry1Ac;其它試劑均為市售分析純。1.1.4主要試驗(yàn)設(shè)備酶標(biāo)儀,美國(guó)Bio-Tek公司;恒溫光照培養(yǎng)箱,南京恒裕;樣品研磨機(jī),德國(guó)Ika公司。1.2測(cè)試方法1.2.1確定適宜的種子粉用量按表1所示的組分和用量制備正常人工飼料。在此基礎(chǔ)上添加一定劑量的種子粉制備抗性種群的篩選飼料。經(jīng)測(cè)定,中棉所41種子中Cry1Ac蛋白含量為1018±159ng·g-1,中棉所44種子中Bt毒蛋白含量為1203±190ng·g-1,根據(jù)應(yīng)加入Cry1Ac蛋白含量換算成相應(yīng)種子粉的含量。各代種子粉的加入量(表2)根據(jù)篩選種群的死亡率進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié),控制種群的死亡率50%左右。每一代棉鈴蟲(chóng)初孵幼蟲(chóng)分別作如下3個(gè)處理:處理一為抗性篩選。根據(jù)上一代毒力測(cè)定數(shù)據(jù),采用殺死種群50%個(gè)體的處理劑量,換算成相應(yīng)種子粉的質(zhì)量加入到融化的人工飼料中(表1,表2),混合均勻,作為篩選抗性種群的飼料。每個(gè)種群接2齡初幼蟲(chóng)3000頭。處理二為抗性測(cè)定。將每個(gè)篩選種群的初孵幼蟲(chóng)在正常飼料上飼養(yǎng)至2齡初,進(jìn)行LC50毒力測(cè)定。處理三為適合度調(diào)查。每一代每個(gè)篩選種群選取100頭2齡初幼蟲(chóng),接入加有飼料的試管內(nèi),每管1頭并逐一加以編號(hào),飼養(yǎng)飼料與抗性篩選飼料相同。觀察記錄各篩選種群適合度變化情況。棉鈴蟲(chóng)飼養(yǎng)條件:幼蟲(chóng)在20mm×100mm試管中單頭飼養(yǎng),試管用棉塞塞緊;成蟲(chóng)在產(chǎn)卵籠中用10%的蜂蜜水補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在(27±1)℃,相對(duì)濕度控制在60%~85%之間,光周期14∶10(L∶D)。1.2.2種群與飼料的配制將Cry1Ac毒素配置成500μg·mL-1的母液,用無(wú)菌水配制7個(gè)不同濃度梯度備用(表3)。為了更準(zhǔn)確地?cái)M合濃度-死亡率曲線,AYBT種群使用1#-5#濃度,AYBC種群使用2#-6#濃度,對(duì)照AYCK種群使用3#-7#濃度,以清水作為空白對(duì)照。按表1所示的組分和用量配制人工飼料,將仍處于液體狀態(tài)的飼料倒入24孔培養(yǎng)板小孔中,每孔倒入飼料量不超過(guò)小孔深度的2/3,飼料凝固后,清除孔壁粘結(jié)的飼料。然后在24孔培養(yǎng)板小孔中分別加入100μLCry1Ac毒素溶液,每個(gè)濃度的Cry1Ac毒素溶液處理一個(gè)24孔板,重復(fù)3次。待毒素溶液被完全吸收后,放在4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?4孔培養(yǎng)板中每孔接入1頭2齡初幼蟲(chóng),然后置于恒溫光照培養(yǎng)箱中26±1℃避光飼養(yǎng),5d后檢查幼蟲(chóng)死亡率。1.2.3成蟲(chóng)釋放后的生殖每天觀察記錄3個(gè)棉鈴蟲(chóng)種群幼蟲(chóng)的存活情況和生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)度,化蛹后第3天稱量蛹重。成蟲(chóng)羽化后,每個(gè)棉鈴蟲(chóng)種群選擇5對(duì)成蟲(chóng)釋放到交配籠中(直徑14cm、高15cm)交配,用10%蜂蜜水飼養(yǎng)成蟲(chóng),每個(gè)種群重復(fù)3次。每天更換產(chǎn)卵用紗布,記載產(chǎn)卵數(shù)量。每個(gè)種群挑取落卵量最高的紗布放置在直徑為9cm的培養(yǎng)皿中,用封口膜密封置于培養(yǎng)箱中遮光孵化,統(tǒng)計(jì)可孵化卵的數(shù)量,計(jì)算孵化率。1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析抗性倍數(shù)為篩選種群的LC50與敏感種群LC50的比值。篩選種群的適合度數(shù)據(jù)用SAS軟件進(jìn)行方差分析、多重比較(Duncan法)和相關(guān)性分析。毒力測(cè)定的數(shù)據(jù)采用PoloPlus軟件計(jì)算LC50、置信區(qū)間,并擬合毒力回歸曲線。2結(jié)果與分析2.1選擇小組的適應(yīng)性2.1.1棉鈴蟲(chóng)的成蟲(chóng)發(fā)育歷期和成蟲(chóng)產(chǎn)卵量棉鈴蟲(chóng)取食轉(zhuǎn)雙價(jià)基因棉、轉(zhuǎn)單價(jià)基因棉篩選材料后,其適合度發(fā)生了較大的變化,3個(gè)種群經(jīng)過(guò)23-26代連續(xù)4代篩選,各適合度參數(shù)均值結(jié)果見(jiàn)表4。與常規(guī)對(duì)照AYCK種群相比,棉鈴蟲(chóng)AYBC種群和AYBT種群的幼蟲(chóng)發(fā)育歷期均明顯延長(zhǎng),分別延長(zhǎng)了10.6d和6.8d,且差異達(dá)到極顯著水平。AYBC和AYBT種群的蛹重明顯減輕,其中AY-BC種群減少80.0mg,差異達(dá)到極顯著水平;AYBT種群減少69.2mg,差異顯著。AYBC種群和AYBT種群的蛹發(fā)育歷期差異不顯著;AYBC種群的雌蟲(chóng)比率顯著降低(降7.5個(gè)百分點(diǎn)),AYBT種群的差異不顯著;AYBT和AYBC種群的成蟲(chóng)產(chǎn)卵量分別減少119和153粒,差異均達(dá)極顯著水平;AYBC和AYBT種群的卵孵化率顯著降低,分別降低29.7個(gè)百分點(diǎn)和22.6個(gè)百分點(diǎn)。與AYBT種群相比,AYBC種群棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)發(fā)育歷期延長(zhǎng)3.8d,產(chǎn)卵量減少24.5粒,差異均顯著;蛹重減輕10.8mg,蛹?xì)v期延長(zhǎng)0.1d,雌蟲(chóng)比率降低2.8個(gè)百分點(diǎn),卵孵化率降低7.1個(gè)百分點(diǎn),但是差異并不顯著(表4)。以上結(jié)果表明,轉(zhuǎn)雙價(jià)基因棉和轉(zhuǎn)單價(jià)基因棉明顯地抑制了棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)度,降低了棉鈴蟲(chóng)成蟲(chóng)的生殖力。主要表現(xiàn)在幼蟲(chóng)的發(fā)育歷期延長(zhǎng),蛹重減輕,產(chǎn)卵量減少,卵孵化率降低。與單價(jià)棉相比,轉(zhuǎn)雙價(jià)(Bt+CpTI)棉對(duì)棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的發(fā)育歷期和成蟲(chóng)產(chǎn)卵量有更強(qiáng)的抑制作用。2.1.2不同篩選級(jí)數(shù)的幼蟲(chóng)發(fā)育歷期和成蟲(chóng)重的相關(guān)分析23-26代各篩選種群的篩選劑量維持在350g,各篩選種群的適合度變化情況如表5所示。AYBC種群的幼蟲(chóng)發(fā)育歷期、蛹重和蛹發(fā)育歷期雖然在篩選代數(shù)間有顯著差異,但是相關(guān)性不顯著;這說(shuō)明隨著篩選代數(shù)的增加,三者均無(wú)明顯變化趨勢(shì)。雌蟲(chóng)比率在篩選代數(shù)間沒(méi)有明顯的差異,與篩選代數(shù)間亦無(wú)明顯相關(guān)性,這說(shuō)明隨著篩選代數(shù)的增加,雌蟲(chóng)比率無(wú)明顯變化趨勢(shì)。成蟲(chóng)產(chǎn)卵量有逐代增加的趨勢(shì),其與篩選代數(shù)間呈顯著正相關(guān)(r=1.00,P<0.01)。卵孵化率上升趨勢(shì)明顯,其與篩選代數(shù)間呈顯著正相關(guān)(r=0.95,P<0.05)。這說(shuō)明隨著篩選代數(shù)的增加,AYBC種群成蟲(chóng)的產(chǎn)卵量和卵孵化率不斷回升。AYBT種群的幼蟲(chóng)發(fā)育歷期在篩選代數(shù)間具有顯著差異,但是相關(guān)性不顯著。蛹重雖有上升趨勢(shì),但差異不顯著,與篩選代數(shù)間也無(wú)明顯相關(guān)性。蛹?xì)v期26代與23-25代差異顯著,與篩選代數(shù)間有顯著相關(guān)性。雌蟲(chóng)比率在篩選代數(shù)間沒(méi)有明顯的差異,亦無(wú)明顯相關(guān)性。產(chǎn)卵量雖有明顯的上升趨勢(shì),但是與篩選代數(shù)的相關(guān)性并不顯著(P>0.05),這可能是樣本數(shù)偏少導(dǎo)致誤差偏大所致。卵孵化率有明顯上升趨勢(shì),且與篩選代數(shù)間呈顯著正相關(guān)(r=0.95,P<0.05)。雖然23代與24代AYCK種群的幼蟲(chóng)發(fā)育歷期有顯著差異,25-26代蛹?xì)v期與23代和24代有顯著差異,但是兩者與篩選代數(shù)的相關(guān)性不顯著。雌蟲(chóng)比率、產(chǎn)卵量和孵化率在篩選代數(shù)間均無(wú)顯著差異,相關(guān)性也不顯著。蛹重隨篩選代數(shù)增加明顯增加,且呈顯著正相關(guān)(r=0.94,P<0.05)。以上結(jié)果表明,與對(duì)照相比,AYBC和AYBT種群的幼蟲(chóng)發(fā)育歷期延長(zhǎng),蛹重減輕,且并未隨著篩選代數(shù)的增加而出現(xiàn)適應(yīng)性的變化;而AYBC、AYBT種群的卵孵化率和AYBC種群的產(chǎn)卵量則隨著篩選代數(shù)的增加有所回升。2.2雙價(jià)棉和獨(dú)立棉群對(duì)大鼠棉在抗性篩選過(guò)程中,使用抗性倍數(shù)法測(cè)定了17-26代棉鈴蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac毒素的抗性發(fā)展水平。經(jīng)過(guò)26代篩選,棉鈴蟲(chóng)種群對(duì)Cry1Ac殺蟲(chóng)蛋白的抗性仍處于較低的水平,AYBC種群對(duì)Cry1Ac的抗性倍數(shù)為5.6,AYBT種群對(duì)Cry1Ac的抗性倍數(shù)為11.4(表6)。比較17-26代AYBC和AYBT種群LC50的95%置信限,除17代和26代外,其余各代(18-25代)兩種群LC50的95%置信限均重疊,即兩種群的LC50值的差異不顯著,兩個(gè)種群同一代的抗性倍數(shù)差異不顯著。這說(shuō)明雙價(jià)棉與單價(jià)棉在抗性篩選過(guò)程中(17-26代)對(duì)篩選種群的抗性誘導(dǎo)作用相同,即雙價(jià)棉與單價(jià)棉對(duì)非抗性個(gè)體的作用效果沒(méi)有明顯差異。結(jié)合2008年孫志新對(duì)AYBT和AYBC種群8-16代的測(cè)定結(jié)果,兩種群的抗性倍數(shù)變化如圖1所示。在抗性篩選過(guò)程中,AYBT和AY-BC種群對(duì)Cry1Ac的抗性倍數(shù)并不穩(wěn)定,起伏波動(dòng)的幅度比較大(17-26代)。篩選種群的抗性倍數(shù)與篩選代數(shù)的相關(guān)曲線(圖2)顯示:AYBC和AYBT種群的抗性倍數(shù)與篩選代數(shù)均呈顯著正相關(guān)。這表明,隨著篩選代數(shù)的增加,兩種群的抗性倍數(shù)有上升趨勢(shì)。AYBC種群和AYBT種群抗性倍數(shù)的相關(guān)曲線(圖3)所示,兩種群的抗性倍數(shù)呈顯著正相關(guān)(r=0.763,P=0.0001),這表明兩種群有相同的抗性發(fā)展趨勢(shì)。以上結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)26代的篩選,棉鈴蟲(chóng)雖然還沒(méi)有對(duì)Cry1Ac毒素產(chǎn)生抗性,但耐受性有所升高。雙價(jià)棉與單價(jià)棉對(duì)棉鈴蟲(chóng)的抗性選擇作用差異不顯著。3抗蟲(chóng)棉對(duì)棉鈴蟲(chóng)的適宜度昆蟲(chóng)對(duì)Bt抗性的發(fā)展會(huì)受到諸多因素的影響,如抗性遺傳方式、抗性基因頻率以及相對(duì)適合度等。無(wú)論是基于何種形式的抗性,抗性昆蟲(chóng)與敏感昆蟲(chóng)的適合度必然存在一些差異,這些差異主要表現(xiàn)在形態(tài)指標(biāo)、生理反應(yīng)、行為特性和生物學(xué)特性等方面。這些與抗性相關(guān)的適合度參數(shù)是抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要依據(jù),也是了解抗性演化及解決抗性問(wèn)題的基礎(chǔ)。2000年Oppert等的研究證實(shí),印度谷螟的Bt抗性種群中幼蟲(chóng)發(fā)育歷期延長(zhǎng),種群存活率也明顯下降。2008年Liang等研究表明,抗性棉鈴蟲(chóng)的相對(duì)適合度隨其對(duì)Bt毒蛋白抗性倍數(shù)的增加而減小,主要體現(xiàn)在幼蟲(chóng)發(fā)育歷期延長(zhǎng)、幼蟲(chóng)體重和蛹重明顯減輕,成蟲(chóng)產(chǎn)卵量和卵孵化率明顯降低。楊峰山等的研究表明,小菜蛾的2個(gè)Bt抗性種群的產(chǎn)卵量和卵孵化率顯著下降,雌雄比例降低,雌蟲(chóng)數(shù)量減少,平均壽命變短。Alyokhin等發(fā)現(xiàn)馬鈴薯甲蟲(chóng)的Cry3A抗性種群的雄蛾交配次數(shù)、雌蛾產(chǎn)卵率、卵孵化率等均低于敏感種群。本研究的結(jié)果也表明棉鈴蟲(chóng)在經(jīng)轉(zhuǎn)單價(jià)基因棉篩選26代后,AYBT種群適合度發(fā)生了明顯的變化,主要表現(xiàn)在幼蟲(chóng)發(fā)育歷期延長(zhǎng)、蛹重減輕、產(chǎn)卵量和卵孵化率降低。目前,國(guó)內(nèi)多數(shù)有關(guān)抗蟲(chóng)棉對(duì)棉鈴蟲(chóng)適合度影響的研究?jī)H著眼于轉(zhuǎn)單價(jià)基因棉花,而本文還研究了轉(zhuǎn)雙價(jià)基因棉花對(duì)棉鈴蟲(chóng)適合度的影響。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)Bt+CpTI棉對(duì)棉鈴蟲(chóng)適合度的影響與轉(zhuǎn)Bt棉相似,但雙價(jià)棉對(duì)棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的發(fā)育和成蟲(chóng)產(chǎn)卵量有更強(qiáng)的抑制作用。Coustau等曾報(bào)道抗性個(gè)體的適合度變化可能只是昆蟲(chóng)適應(yīng)逆境的生理學(xué)或生物學(xué)特性的變化,也可能是在藥劑的選擇下昆蟲(chóng)產(chǎn)生了抗性突變。本研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照相比,AYBC和AYBT種群的幼蟲(chóng)發(fā)育歷期延長(zhǎng),蛹重下降,且并沒(méi)有隨著篩選代數(shù)的增加而有所緩和。這一結(jié)果可能說(shuō)明,幼蟲(chóng)發(fā)育歷期的延長(zhǎng)和蛹重的減少不是昆蟲(chóng)適應(yīng)逆境的生理學(xué)變化,而是由基于基因水平上的變異造成的。AYBC和AYBT種群的卵孵化率和產(chǎn)卵量隨著篩選代數(shù)的增加而有所回升,這一結(jié)果說(shuō)明兩種群中產(chǎn)卵量和卵孵化率的降低可能只是昆蟲(chóng)適應(yīng)逆境的生理學(xué)變化。本研究結(jié)果可能初步驗(yàn)證了Coustau的觀點(diǎn),有待后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。此外,2個(gè)種群經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)26代的篩選后,棉鈴蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac毒素產(chǎn)生了一定耐受性,AYBC種群和AYBT種群抗性倍數(shù)分別為5.63和14.44。但是在篩選的17-26代,兩種群的LC50差異并不顯著,即同一代中兩個(gè)種群的抗性倍數(shù)差異并不顯著。這說(shuō)明對(duì)于敏感或者耐受性較低的棉鈴蟲(chóng),單價(jià)棉與雙價(jià)棉對(duì)其作用效果相同。與單價(jià)棉相比,雙價(jià)棉延緩抗性發(fā)展的優(yōu)勢(shì)可能更多地體現(xiàn)在對(duì)Cry1Ac高耐受性或者是抗性個(gè)體上。芮昌輝等的研究結(jié)果表明,轉(zhuǎn)雙價(jià)基因棉對(duì)Cry1Ac產(chǎn)生16倍抗性的棉鈴蟲(chóng)的控制效果高于單價(jià)棉。高聰芬等的研究結(jié)果也表明轉(zhuǎn)雙價(jià)基因棉無(wú)論是對(duì)抗性棉鈴蟲(chóng)還是敏感棉鈴蟲(chóng)的抗蟲(chóng)性都顯著或稍高于單價(jià)棉。研究棉鈴蟲(chóng)抗性與其適合度間相互關(guān)系的最終目的是為制定抗性治理策略提供科學(xué)依據(jù),并指導(dǎo)抗性治理的實(shí)施。近年來(lái),