FHIT基因異常轉(zhuǎn)錄與宮頸癌相關(guān)性的研究.doc

【摘要】 目的 探討脆性組氨酸三聯(lián)體（FHIT）基因與宮頸癌發(fā)病的關(guān)系。方法 采用巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（nested RT-PCR)及DNA直接測序法對15例正常宮頸組織、30例宮頸癌組織及配對癌旁正常組織、宮頸癌Hela細胞系進行FHIT基因異常轉(zhuǎn)錄分析，并選擇1例正常轉(zhuǎn)錄本及2例異常轉(zhuǎn)錄本進行DNA序列分析。結(jié)果 除7例宮頸癌組織及1例癌旁正常組織外，其余標本均擴增出FHIT基因野生型轉(zhuǎn)錄本。Hela細胞系同時存在野生型及異常轉(zhuǎn)錄本。FHIT基因的異常轉(zhuǎn)錄率在宮頸癌組織為47%（14/30），高于癌旁正常組織20%（6/30）及正常宮頸組織13%（2/15），差異均有顯著性（P0.05)。FHIT基因的異常轉(zhuǎn)錄與癌組織的生物學(xué)特性無關(guān)。DNA測序證明異常轉(zhuǎn)錄本為FHIT基因多個外顯子的缺失及DNA序列的插入。結(jié)論 FHIT基因的異常轉(zhuǎn)錄是宮頸癌組織及Hela細胞系中的常見事件，可能與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】 子宮頸腫瘤；基因脆性組氨酸三聯(lián)體；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；轉(zhuǎn)錄；遺傳 Study on association of aberrant fragile histidine triad gene transcripts with human cervical cancerLI Fu-qin,WANG Wei.Department of Obstetrics and Gynecology,The 2nd Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150086,China【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the fragile histidine triad (FHIT) gene and human cervical cancer.Methods Normal cervical tissues from 15 patients,cancerous and matched adjacent normal tissues from 30 patients with cervical cancer and Hela cell line were examined for abnormalities of the FHIT gene transcripts by nested RT-PCR.1 normal and 2 abnormal samples were selected for DNA direct sequencing.Results Wild-type FHIT gene transcripts were found in all samples except 7 cancerous tissues and 1 adjacent normal tissues.There were wild-type and aberrant transcripts in Hela cell line.Abnormal FHIT gene transcripts were obtained from 47%(14/30) cancerous tissues,20%(6/30) matched adjacent normal tissues and 13%(2/15) normal tissues.The rate of aberrant FHIT transcripts in cancerous tissues was significantly higher than that in their matched adjacent normal tissues and normal tissues(P0.05).Clinicopathological analysis of patients showed that aberrant transcripts of the FHIT gene had no correlation with biological features of the tumors.Sequence analysis of the aberrant transcripts confirmed the absence of several exons of the FHIT gene and insertions of DNA sequences.Conclusion The expression of aberrant FHIT gene transcripts is common in cervical cancer and Hela cell line.Abnormalities of the FHIT gene may be associated with cervical tumorigenesis.【Key words】 cervix neoplasms;genes FHIT;RT-PCR;transcription;genetic 3p染色體的雜合性缺失是宮頸癌中的常見事件，提示可能隱伏著與宮頸癌發(fā)生相關(guān)的抑癌基因。自1996年Ohta等1用外顯子捕獲法在3p14.2區(qū)克隆出脆性組氨酸三聯(lián)體（fragile histidine triad,FHIT)基因以來，已在多種惡性腫瘤細胞系及原發(fā)腫瘤中檢測到該基因的異常，主要包括基因的純合性缺失、雜合性缺失及異常轉(zhuǎn)錄。有關(guān)宮頸癌中FHIT基因的研究在國外雖日趨深入，但結(jié)果不盡相同，本研究采用巢式RT-PCR及PCR產(chǎn)物直接測序法檢測了正常宮頸組織、宮頸癌組織及其配對癌旁正常組織、宮頸癌Hela細胞系中FHIT基因的表達，以期從轉(zhuǎn)錄水平闡明FHIT基因異常與宮頸癌發(fā)生及癌組織生物學(xué)特性的關(guān)系。1 材料與方法1.1 材料來源 收集2001年411月我院婦產(chǎn)科手術(shù)切除的30例宮頸癌標本及同一患者距癌組織最遠處的癌旁正常組織各0.10.5cm3，取因良性腫瘤手術(shù)切除的正常宮頸組織15例作為對照，所有標本術(shù)后迅速置液氮內(nèi)冷凍，然后貯存于-70深凍冰箱中。手術(shù)患者術(shù)前均未經(jīng)過放療、化療。所有宮頸癌標本均經(jīng)術(shù)后病理證實，其中鱗癌26例，腺癌4例；期12例，期18例；年齡2762歲，平均46.5歲。宮頸癌Hela細胞均已妥善凍存。1.2 方法1.2.1 總RNA提取 按照廠商介紹的方法，應(yīng)用TRIzol試劑（GIBCO BRL公司）提取組織及細胞中總RNA，溶于無RNA酶的DEPC水中。取1lRNA于DNA、RNA、蛋白濃度測定儀上測定其濃度及OD260/OD280值，選擇此值1.6的樣品稀釋至1g/l,-70凍存?zhèn)溆谩?.2.2 逆轉(zhuǎn)錄 取1g總RNA，用Reverse Transcription System(Promega公司）試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，引物為Oligo(dT)15。1.2.3 巢式PCR 以巢式PCR法擴增出FHIT基因Exon3Exon10707bp的片段，引物序列參照文獻1。外引物5U2：5-ATCCTGGAAGCTTTGAAGCTCA-3,3D2:5-TCACTGGTTGAAGAATACAGGA-3;內(nèi)引物5U1：5-TCCGTAGTGCTATCTACATC-3，3D1：5-CATGCTGATTCAGTTCCTCTTGG-3。以-actin509bp長的片段作為內(nèi)對照，引物序列為：P1:5-GAAATCGTGCGTGACATTAAG-3,P2:5-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3。第一輪PCR反應(yīng)：20l反應(yīng)體系中含cDNA模板2l,dNTP(10mM)1l,MgCl2(25mM)1.5l,FHIT基因外引物5U2、3D2或-actin引物P1、P2（10mM)各2l,Taq酶（5u/l)0.3l,10Buffer 2l。在PE Biosystems 9700型PCR儀上進行擴增，條件如下：95預(yù)變性5min，然后9530s、5830s、7230s共35個循環(huán)，72延伸10min。將第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋20倍后取2l作為模板，以內(nèi)引物5U1、3D1按第一輪反應(yīng)體系及條件進行第二輪PCR反應(yīng)。同時設(shè)置以總RNA為模板進行巢式PCR反應(yīng)的陰性對照。1.2.4 產(chǎn)物檢測 各取8l第一輪及第二輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物上樣于2%的瓊脂糖凝膠（含EB）進行電泳，紫外燈下觀察-actin及FHIT基因兩輪PCR產(chǎn)物條帶，并攝影記錄。1.2.5 DNA測序 選擇第二輪擴增宮頸癌旁正常組織中FHIT基因正常大小707bp轉(zhuǎn)錄本1例及宮頸癌組織中大小約250bp、350bp的異常轉(zhuǎn)錄本各1例，擴大反應(yīng)體積至50l重復(fù)PCR反應(yīng)。取40l PCR擴增產(chǎn)物進行2%低熔點瓊脂糖凝膠（含EB）電泳，在紫外燈下觀察并回收FHIT基因mRNA轉(zhuǎn)錄片段。應(yīng)用Wizard PCR Preps DNA Purification System(Promega公司）純化回收擴增片段。應(yīng)用上游引物5U1及熒光素標記的dNTP(PE公司測序試劑盒）擴增純化后的cDNA,在ABI PRISM TM377自動測序儀中進行測序。1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 兩樣本率的比較采用四格表2檢驗或Fisher精確概率法進行統(tǒng)計分析。2 結(jié)果2.1 RT-PCR結(jié)果2.1.1 各標本電泳結(jié)果 所有標本cDNA經(jīng)第一輪PCR擴增，電泳均可檢測到-actin509bp的完整條帶，但均未檢獲FHIT基因擴增產(chǎn)物；經(jīng)第二輪擴增后除7例癌組織及1例癌旁正常組織外，其余標本均檢測到FHIT基因707bp野生型轉(zhuǎn)錄本。其中15例正常宮頸上皮組織中2例（13%）同時存在約250bp的異常轉(zhuǎn)錄本。Hela細胞系同時存在707bp及約300bp兩種形式的轉(zhuǎn)錄本。見圖1。在30例宮頸癌標本中，23例（77%）有FHIT基因707bp正常轉(zhuǎn)錄，其中7例同時存在12條短片段的異常轉(zhuǎn)錄，其余7例（23%）癌組織中并無正常大小轉(zhuǎn)錄本的擴增，包括1例轉(zhuǎn)錄缺失及6例不同大小的短片段異常轉(zhuǎn)錄。在異常轉(zhuǎn)錄中，以250bp及350bp片段較常見，且1例同時出現(xiàn)這兩種異常轉(zhuǎn)錄。在30例癌旁正常組織中，只有1例（3%）未擴增出707bp片段而只有250bp小片段異常轉(zhuǎn)錄本，5例（17%）同時存在正常及異常轉(zhuǎn)錄本。以RNA為模板的陰性對照均未擴增出任何條帶，見圖2。圖1 圖2 略2.1.2 FHIT基因在正常宮頸組織、宮頸癌組織及癌旁正常組織中轉(zhuǎn)錄情況的比較 見表1。FHIT基因的異常轉(zhuǎn)錄率在宮頸癌組織（47%，14/30）高于正常宮頸組織（13%，2/15），差異有顯著性（P0.05)，同時高于癌旁正常組織（20%，6/30），差異有顯著性（P0.05)。2.1.3 FHIT基因異常轉(zhuǎn)錄與宮頸癌組織生物學(xué)特性的關(guān)系 見表2。基因的異常轉(zhuǎn)錄在宮頸癌臨床分期、組織類型、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移及腫瘤大小之間差異均無顯著性（P0.05)。表1 FHIT基因在正常宮頸組織、宮頸癌組織及癌旁正常組織中轉(zhuǎn)錄情況的比較略表2 FHIT基因異常轉(zhuǎn)錄與宮頸癌組織生物學(xué)特性的關(guān)系略圖3A 略2.2 測序結(jié)果 選擇1例癌旁正常宮頸組織約707bp的擴增產(chǎn)物進行測序，與Genebank FHIT 基因cDNA序列相比較，結(jié)果一致，證實有FHIT基因Exon3Exon10的完整轉(zhuǎn)錄。選擇宮頸癌組織異常轉(zhuǎn)錄本中大小約350bp、250bp的擴增產(chǎn)物進行測序，證實1例為331bp，Exon5Exon8缺失，同時在Exon4和Exon9之間存在一段不明來源的98bp序列的插入（圖3A），另1例為249bp，Exon4Exon8部分缺失（圖3B）。圖3B 略3 討論現(xiàn)已公認腫瘤是一種基因型疾病，多種癌基因和抑癌基因的協(xié)同作用導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)常發(fā)生染色體缺失的部位可能有抑癌基因的存在，而脆性位點增加腫瘤形成中染色體缺失的可能性。故FHIT基因，作為第一個將脆性位點與腫瘤聯(lián)系起來的候選抑癌基因，備受研究者們的關(guān)注。目前已發(fā)現(xiàn)該基因在多種實體瘤，如肺1、腎2、宮頸3、消化道2及頭頸部腫瘤4中存在異常轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)為外顯子的缺失及內(nèi)源序列的插入，同時伴有DNA的缺失及FHIT蛋白的表達減少或缺失3,5,6。FHIT基因位于3p14.2區(qū)，包含t（3；8）易位斷裂點及脆性部位FRA3B。該基因全長1Mb，共10個外顯子，其中Exon5Exon9為開放性閱讀框（ORF），編碼16.8kD的蛋白質(zhì)2，后者是一種Ap3A水解酶，能水解ApnA(n=36)生成ADP和AMP7。內(nèi)含子4中存在HPV16整合位點，宮頸癌中HPV16整合在此位點可導(dǎo)致包括Exon5的大片段基因的缺失8。宮頸組織中對于FHIT基因異常轉(zhuǎn)錄頻率的分析，各試驗所得結(jié)果不一致，在癌組織中為30%80%，正常組織中為040%3，914。本實驗采用巢式RT-PCT法，檢測了15例正常宮頸組織，30例宮頸癌及其癌旁正常組織及宮頸癌Hela細胞系中FHIT基因的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果顯示，所有標本的cDNA均經(jīng)第二輪PCR擴增方能檢獲FHIT基因擴增產(chǎn)物，表明在宮頸組織中FHIT基因普遍以低水平表達，這與其他學(xué)者在胃腸道腫瘤等其他腫瘤中得到的結(jié)果一致15。實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)HIT基因的異常轉(zhuǎn)錄率在宮頸癌組織高于正常宮頸組織及癌旁正常組織，這與Su11、Yoshino12、Segawa14得到的結(jié)論相似，初步證明FHIT基因的異常轉(zhuǎn)錄與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。本實驗中23%（7/30）的癌組織中只擴增出不同大小的異常轉(zhuǎn)錄片段，無野生型轉(zhuǎn)錄本存在，其中包括1例轉(zhuǎn)錄缺失，說明FHIT兩等位基因均失活。與其他實驗者11，12，14得到的結(jié)論相似，筆者發(fā)現(xiàn)部分有FHIT異常轉(zhuǎn)錄的癌組織中同時含有正常轉(zhuǎn)錄本，這種現(xiàn)象可能因腫瘤組織混有正常細胞或腫瘤細胞存在異質(zhì)性，即癌灶由不同的細胞克隆構(gòu)成，其癌變是由于不同的基因改變方式所致。宮頸癌Hela細胞系中亦同時存在正常與異常轉(zhuǎn)錄本，這與Druck等5得到的結(jié)果相似，說明FHIT基因的改變并非完全是克隆性的。由此推測FHIT基因可能通過不同于經(jīng)典抑癌基因的失活機制起作用，F(xiàn)HIT基因變異可能發(fā)生在單等位基因上，剩余的等位基因仍能轉(zhuǎn)錄野生型cDNA。同時實驗結(jié)果顯示，13%（2/15）的正常細胞中也存在250bp的異常轉(zhuǎn)錄，許多學(xué)者在其他正常組織中亦得到相似結(jié)論16，17，并且發(fā)現(xiàn)衰老細胞中這種異常轉(zhuǎn)錄所占比例增加18，這一轉(zhuǎn)錄本同時在5例癌旁正常組織及3例癌組織中出現(xiàn)，推測正常情況下FRA3B脆性位點就有一定頻率的斷裂，它只反映了RNA斷裂保守性的下降并非腫瘤特異性，如果此種損傷達到一定程度亦可能導(dǎo)致細胞癌變。本實驗另一常見異常轉(zhuǎn)錄為331bp片段，由于此種異常轉(zhuǎn)錄僅在癌組織中及1例癌旁正常組織中出現(xiàn)，正常組織中并不存在，推測可能為腫瘤特異性的異常轉(zhuǎn)錄，與正常組織中的異常轉(zhuǎn)錄本相比由不同機制產(chǎn)生，與文獻報道一致11。此例癌旁正常組織中的異常轉(zhuǎn)錄可能是由于部分已發(fā)生癌變的組織造成的。本實驗2例異常轉(zhuǎn)錄均存在Exon5及Exon8的缺失，由于Exon5是編碼功能蛋白質(zhì)的第一外顯子，而Exon8編碼三原組氨酸功能區(qū)，故它們的缺失可導(dǎo)致FHIT基因功能蛋白質(zhì)的產(chǎn)生缺如。按照Barnes等7的推測可能使FHIT蛋白抑制細胞增殖和（或）促進細胞凋亡的功能喪失，從而引起組織細胞異常增生而致使機體腫瘤的發(fā)生。Exon4的缺失提示在宮頸癌的發(fā)生中，F(xiàn)HIT非編碼區(qū)可能發(fā)揮某種調(diào)控作用，從而影響FHIT基因表達和FHIT蛋白的功能。本實驗同時考察了FHIT異常轉(zhuǎn)錄與宮頸癌臨床分期、病理類型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小的關(guān)系，證實FHIT異常轉(zhuǎn)錄與宮頸癌的生物學(xué)特性無關(guān)，與段曉明等15在大腸癌組織中研究FHIT異常轉(zhuǎn)錄得到的結(jié)論一致。本實驗通過巢式RT-PCR方法在轉(zhuǎn)錄水平證實了FHIT基因異常轉(zhuǎn)錄確與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，但與癌組織生物學(xué)特性無關(guān)，經(jīng)DNA測序證實異常轉(zhuǎn)錄本涉及多個外顯子的缺失，并且推測其中一種異常轉(zhuǎn)錄可能為腫瘤細胞特有的轉(zhuǎn)錄形式。雖然該基因可能并非通過經(jīng)典抑癌基因的途徑發(fā)揮作用，但越來越多的研究結(jié)果顯示重建FHIT基因的表達能有效誘導(dǎo)凋亡及抑制宮頸癌細胞系在動物體內(nèi)的成瘤性19。研究并闡明FHIT基因異常轉(zhuǎn)錄的確切機制、FHIT蛋白的功能以及對細胞增殖與凋亡的調(diào)節(jié)作用，可能為闡明包括宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生機制提供新的線索，為其早期診斷、預(yù)后及基因治療提供理論依據(jù)?！緟⒖嘉墨I】1 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