臍血源樹突狀細胞促進T細胞對 腫瘤細胞的殺傷效應

1、臍血源樹突狀細胞促進T細胞對 腫瘤細胞的殺傷效應曲新棟曲政海，左建新，孫立榮【關(guān)鍵詞】臍血單個核細胞樹突狀細胞腫瘤細胞免疫成效EnhaningEffetfDendritiellsDerivedfrHuanrdBldnTellsinKillingTurellsKeyrdsrdbld；nnulearell；dendritiell；turell；iunefuntinJExpHeatl2022;15(3):586-590重要東西重要試劑標本網(wǎng)羅臍血取自青島大學醫(yī)學院隸屬病院產(chǎn)科康健足月安產(chǎn)新生兒。臍血單個核細胞BN的制備1肝素鈉抗凝的臍血5l，參加5lRPI1640造就液等體積稀釋。將稀釋臍血以31沿

2、管壁遲鈍加至淋巴細胞分散液上面。1500g離心20分鐘。離心后上層與中層接壤處渾濁的灰白色層即為單個核細胞層。用尖頭滴管輕輕插入灰白色層，吸出該層的單個核細胞。將RPI1640造就液參加Ep管中混勻單個核細胞懸液，13300g離心5分鐘,棄去上清，重復洗滌2次。用RPI1640造就液調(diào)解單個核細胞懸液濃度為1107/l，分成2份，此中1份用作于D的誘導分化，另1份用作于T細胞的分散。D的誘導分化D的斷定接納間接免疫熒光法斷定D。參加鼠抗人D1a抗體一抗50l，混勻，4孵育留宿。用PBS洗滌2次，參加FIT標識表記標幟的兔抗鼠抗體二抗50l，混勻，4孵育30分鐘。以PBS洗滌2次,取1滴細胞懸液

3、滴于載玻片上，加蓋蓋玻片。在熒光顯微鏡下先用平凡透射光計數(shù)視野中的單個核細胞，然后用紫外光計數(shù)同一視野中的熒光陽性細胞，盤算D的百分率。T細胞的尼龍棉柱法分散將0.5l單個核細胞懸液參加尼龍棉柱內(nèi)，平放尼龍棉柱，以滴管伸入柱內(nèi)近尼龍棉界面，滴加0.2l預溫至37的含10%胎牛血清的RPI1640造就液后封口，平置于37溫箱中孵育30分鐘，用預溫至37的上述溶液5-10l洗柱,再用20-25l上述溶液充實洗去殘留的T細胞，洗下的懸液即為分散的T細胞。T細胞的凍存及清醒將T細胞懸液750g離心5分鐘,棄去上清。向沉淀物中參加由1份DS和9份RPI1640造就液配制而成的凍存液，使細胞密度為1107

4、/l。先將凍存管放在4冰箱45分鐘,然后置于-2060分鐘，末了將凍存管投入液氮中保存。恒溫水浴箱溫度調(diào)至37。從液氮中取出凍存管，敏捷投入37溫水中快速晃動，直至凍存液完全溶解。將凍存T細胞懸液移入離心管中，參加5lRPI1640造就液，輕輕吹打勻稱。將細胞懸液750g離心5分鐘,棄去上清。向細胞沉淀物中參加造就液，輕輕吹打勻稱，調(diào)解到所需的濃度備用。腫瘤細胞的造就本實行接納神經(jīng)母細胞瘤細胞作為靶細胞。神經(jīng)母細胞瘤細胞造就于含10%胎牛血清的RPI1640造就液中，置37、5%2、飽和濕度的造就箱中造就，細胞貼壁生長，每6-7天傳代1次。傳代時，用滴管吸棄造就液，用PBS洗滌1次，參加2.5

5、胰酶，37造就箱中消化3-5分鐘，用倒置顯微鏡不雅察細胞消化的環(huán)境，待細胞回縮變圓，參加造就液中斷消化，用滴管輕輕吹打，使貼壁的細胞從瓶壁充實游離下來，形成細胞懸液。將細胞懸液網(wǎng)絡到離心管中，750g離心5分鐘，棄去上清，用RPI1640造就液調(diào)解細胞的濃度。實行時取對數(shù)生恒久細胞。用0.1%臺盼藍拒染法斷定活性在98%以上。D刺激的T細胞對腫瘤細胞的殺傷效應以RPI1640造就液調(diào)解T細胞濃度為1106/l,調(diào)解腫瘤細胞濃度為1104/l。實行組加D、1106T細胞及1104腫瘤細胞，終體積為2.5l。比較組不加D，比較組加1106T細胞及1104腫瘤細胞，終體積也為2.5l。實行組別離按D

6、腫瘤細胞=201,501,1001的比例參加D，即別離參加D2105，5105，1106。實行組及比較組另設單獨效應細胞孔及單獨靶細胞孔，以盤算殺傷效應。37、5%2、飽和濕度條件下造就48小時，參加TT使其終濃度為0.5g/l,繼承孵育4小時,停頓造就，750g離心5分鐘后棄去上清，每孔參加DS150l，37振蕩溶解5分鐘，于酶標儀570n處讀取D值，按以下公式盤算殺傷效應：殺傷效應(%)=1-試驗孔D值-效應細胞孔D值/靶細胞孔D值100%統(tǒng)計學處置懲罰接納SPSS11.5統(tǒng)計軟件舉行統(tǒng)計學處置懲罰。實行數(shù)據(jù)以SD表現(xiàn)，接納配對資料的t查驗，P0.01為差異有明顯統(tǒng)計學意義，P0.05為差

7、異有統(tǒng)計學意義。效果D誘導分化歷程中形態(tài)學不雅察D1a+細胞率Figure2.DrphlgyshnbyflureseneirspyusingFITlabeledD1aantibdyafterbeingulturedfr15days400.D對腫瘤細胞的殺傷效應加D的實行組別離與不加D的比較組比力，實行組D刺激的T細胞對腫瘤細胞的殺傷效應均高于比較組，差異具有明顯性意義P0.01。1001組與501組比力，對腫瘤細胞的殺傷效應差異無統(tǒng)計學意義P0.05；1001組對腫瘤細胞的殺傷效應低于201組，差異有統(tǒng)計學意義P0.05；501組對腫瘤細胞的殺傷效應低于201組，差異有統(tǒng)計學意義P0.05。討

8、論D是如今所知的機體內(nèi)成效最強的，也是惟一可以激活初始T細胞的專職性抗原呈遞細胞,是機體免疫應答的始動者，其在腫瘤免疫中飾演著緊張的腳色。如安在短時間內(nèi)得到充足數(shù)目的D是深化研究D生物學特性、成效和臨床應用的條件和關(guān)鍵。多年來人們不停在探究獵取D的有用要領，包羅最初的從含有D的構(gòu)造如皮膚、扁桃體及外周血等中通過密度梯度離心獵取D，以及如今從臍血、骨髓、發(fā)動的外周血的單個核細胞或D34+造血干細胞,乃至從血液體系腫瘤細胞造就得到D。臍血D僅占臍血單個核細胞的0.160.12%2，外周血D也僅占外周血單個核細胞的0.1%-1.0%3，因此直接從臍血或外周血分散獵取D服從低。由于臍血相對輕易得到，臍

9、血單個核細胞對種種造血因子反響、增殖與分化本領強，且在雷同條件下臍血單個核細胞泉源的D與D34+細胞泉源的D具有雷同的成效，這些因素提示人臍血單個核細胞大概是一個可以大量獵取D的抱負泉源4。如今國表里斷定D接納的重要外貌標識表記標幟為D1a分子。本研究接納單克隆抗體間接免疫熒光法檢測表達D1a的D，D1a陽性細胞率為43.125.83%。D1a重要表達于未成熟的D7。有資料表現(xiàn),未成熟的D對腫瘤細胞的殺傷活性是成熟的D的3-4倍8。本研究接納尼龍棉柱法從臍血單個核細胞中分散T細胞，該法輕便快速，不需特別儀器，淋巴細胞活性不受影響，T細胞純度可達90%以上。也可接納免疫磁珠法分散T細胞。為只管制

10、止異基因混淆淋巴細胞反響，進步D的抗腫瘤效應，與其他學者的實行有所差異的是，本實行中誘導分化的D和分散的T細胞均來自同一個個別的臍血。由于D的體外誘導分化必要15天擺布，要做到誘導分化的D和分散的T細胞均來自同一個個別，這就涉及到T細胞的保存及存活題目，我們接納T細胞凍存清醒的要領保存T細胞，效果T細胞的存活率均達95%以上，證明了上述要領的可行性。隨動手術(shù)、化療和造血干細胞移植事情的普及開展，惡性腫瘤患兒的中位保存期已經(jīng)顯著延伸。但是，傳統(tǒng)化療只能使腫瘤細胞呈對數(shù)級落落，治愈腫瘤疾病終極需依靠患兒機體自身免疫細胞發(fā)揮成效，這一范疇的研究正在飛速生長，已經(jīng)給腫瘤疾病的治療帶來了新的理論和計謀。

11、D因其強盛的抗原呈遞成效，已成為惡性腫瘤免疫治療存眷的核心9-11。D作為最緊張的抗原呈遞細胞負載腫瘤抗原后,可以引發(fā)機體抗腫瘤免疫反響。使用其抗原呈遞成效所舉行的樹突狀細胞療法在很多惡性腫瘤的實行性治療中獲得了令人煽動的療效。經(jīng)腫瘤抗原打擊致敏的D,回輸患兒體內(nèi)可以按捺同種腫瘤生長12，如B淋巴細胞瘤13、多發(fā)性骨髓瘤和玄色素瘤等。腫瘤抗原負載D的要擁有以下幾種：腫瘤抗原、D和T細胞配合造就；腫瘤溶解抗原負載D；編碼腫瘤抗原的RNA轉(zhuǎn)染D。本研究接納腫瘤全細胞抗原負載臍血D，臍血D通過臍血T細胞進而發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的效應。試驗效果表白，加D的實行組能明顯進步T細胞對腫瘤細胞的殺傷效應，與比較

12、組比力，差異具有明顯性意義(P0.01)。為了探究D的數(shù)目與T細胞對腫瘤細胞的殺傷效應的干系，我們別離根據(jù)D與腫瘤細胞差異的比例1001，501，201方案實行組，效果為，1001組與501組比力，對腫瘤細胞的殺傷效應差異無統(tǒng)計學意義P0.05；1001組對腫瘤細胞的殺傷效應低于201組，差異有統(tǒng)計學意義P0.05；501組對腫瘤細胞的殺傷效應低于201組，差異有統(tǒng)計學意義P0.05。這些效果提示樹突狀細胞加強抗腫瘤效應大概存在最得當?shù)臐舛?，濃度增大，殺傷效應不必然加強，其確切機制尚不明晰，推測大概與T細胞耗竭有關(guān)。腫瘤細胞作為內(nèi)源性抗原，通過H類途徑被D呈遞給T細胞。T細胞大概通過以下機制發(fā)

13、揮殺傷腫瘤細胞的效應：T細胞活化后大量表達FasL(配體)，F(xiàn)asL和腫瘤細胞外貌的Fas分子受體結(jié)合，通過Fas分子胞內(nèi)段的殞命布局域，激活aspase8，再激活一系列aspase，引起殞命信號的逐級轉(zhuǎn)導，終極激活內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶，使核小體斷裂，并導致細胞布局損毀，細胞殞命。T細胞開釋顆粒溶解素，通過穿孔素形成的孔道進入腫瘤細胞，引起腫瘤細胞的溶解。檢測細胞殺傷效應的要擁有形態(tài)學不雅察、放射性同位素法51r開釋試驗、乳酸脫氫酶開釋法、TT四噻唑藍法和流式細胞術(shù)等。本研究接納TT法。TT法是檢測細胞存活的間接要領14。此法的根本原理是活細胞線粒體的琥珀酸脫氫酶suinatedehydrgenase，SDH能將外源性的TT的四氮唑鹽復原成為不成溶性的紫色結(jié)晶物frazan并沉積在細胞中，frazan被二甲亞砜DS溶解后所出現(xiàn)的色度用D值表現(xiàn)反響出活細胞的數(shù)目和代謝程度。殞命細胞那么無此酶活性，D值低代表細胞線粒體內(nèi)SDH將TT轉(zhuǎn)化為甲臜的本領低，細胞活性低，細胞存活數(shù)目少，效應細胞殺傷效應高。如今國表里已創(chuàng)造，D也具有必然程度的不依靠T細胞的殺傷腫瘤細胞的成效。D與腫瘤細胞系作用后腫瘤細胞出現(xiàn)凋亡征象15,故誘導細