缺血后處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響.doc

缺血后處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響郝宇華郭永清呂國義高春霖【摘要】目的探討缺血后處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響。方法成年雄性SD大鼠40只，體重250-300g，隨機(jī)分為5組（n=8），假手術(shù)組（sham組）：只進(jìn)行麻醉和分離解剖兩側(cè)頸總動脈，缺血再灌注1組（I/R1組）：給予腦缺血30min，再灌注24h，缺血再灌注2組（I/R2組）：給予腦缺血30min，再灌注48h，缺血后處理1組（Post1組）：給予腦缺血30min，缺血后處理后再灌注24h，缺血后處理2組（Post2組）：給予腦缺血30min，缺血后處理后再灌注48h。使用無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈實現(xiàn)腦缺血，撤去動脈夾實現(xiàn)再灌注。在再灌注即刻給予大鼠雙側(cè)頸總動脈松夾15s/夾閉15s，如此三次，實現(xiàn)缺血后處理。實驗結(jié)束處死大鼠，開顱取左側(cè)半球腦組織頂葉皮質(zhì)制作腦組織勻漿，檢測MDA含量和SOD活性。取右側(cè)半球腦組織并作石蠟切片，采用TUNEL法觀察大腦頂葉皮質(zhì)細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果與sham組相比，I/R1組、I/R2組、Post1組、Post2組MDA含量增高，SOD活性降低（P0.05）；與I/R1組相比，Post1組MDA含量降低，SOD活性升高（P0.05）；與I/R2組相比，Post2組MDA含量降低，SOD活性升高（P0.05）；與I/R1組相比，I/R2組MDA含量降低，SOD活性升高（P0.05）；與Post1組相比，Post2組MDA含量降低，SOD活性升高(P0.05)。sham組可見少量凋亡細(xì)胞。與sham組相比，I/R1組、I/R2組、Post1組、Post2組凋亡指數(shù)升高（P0.05）；與I/R1組比較，Post1組凋亡指數(shù)降低（P0.05）；與I/R2組比較，Post2組凋亡指數(shù)降低（P0.05）；與I/R1組相比，I/R2組凋亡指數(shù)降低（P0.05）；與Post1組相比，Post2組凋亡指數(shù)降低（P0.05）。結(jié)論大鼠腦缺血再灌注損傷可以引起細(xì)胞凋亡；缺血后處理對腦缺血再灌注損傷誘發(fā)的細(xì)胞凋亡有抑制作用；缺血后處理可以抑制腦缺血再灌注引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)?！娟P(guān)鍵詞】缺血再灌注；缺血后處理；超氧化物歧化酶；丙二醛；細(xì)胞凋亡Theeffectsofpostconditioningoncerebralischemic/reperfusioninjuryinratcerebrumHAOYu-hua*,LVGuo-yi,GAOChun-lin,etal.Departmentofanesthesia,ShanxiPeoplesHospital,Shanxi030001,China【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectsofpostconditioningonbrainapoptosisoftheSDratinducedbybrainischemic/reperfusionanditsmechanism.BraintissuehomogenatewerecollectedtomeasurethecontentofMDAandtheactivityofSOD.Discussingthebrain-protectivemechanismofpostconditiongandthepotentialclinicalapplication.MethodsFortymaleSDratsweighting250-300gwereanesthetizedby10%chloralhydrateperitonealinjection.Ratswererandomlydividedintofivegroups：(1)Theshamgroup；(2)ischemic/reperfusion1group：brainsweresubjectedto30minsofischemiafollowedby24hoursofreperfusion(I/R1group)；(3)ischemic/reperfusion2group：brainsweresubjectedto30minsofischemiafollowedby48hoursofreperfusion(I/R2group)；(4)postconditioning1group：brainsweresubjectedto30minsofischemiafollowedbythreecirclesof15s/15spostconditioningand24hoursofreperfusion(Post1group)；(5)postconditioning2group:brainsweresubjectedto30minsofischemiafollowedbythreecirclesof15s/15spostconditioningand24hoursofreperfusion(Post2group).Allofthegroupswereassigned8rats.Bilateralcommoncarotidarteryweredissociationandocclusionfor30minfollowedbyreperfusionorreperfusionpluspostconditioning.Attheendoftheexperiment,alloftheratswerekilled.ThebraintissuehomogenatewerecollectedinordertomeasurethecontentofMDAandtheactivityofSOD.Braintissuewerestoredin10%formaldehydesolution，followedbyparaffinsectionandmeasurementoftheapoptosisindex.ResultsInI/R1、I/R2、Post1、Post2groups，MDAwerehigherthaninshamgroup,SODwerelowerthaninshamgroup(P0.05).ComparingtheSOD,thePost1groupandPost2groupwererespectivelyhigherthaninI/R1groupandI/R2group(P0.05)；comparingtheMDA,thePost1groupandPost2groupwererespectivelylowerthaninI/R1groupandI/R2group(P0.05).ComparingtheSOD,theI/R2groupandPost2groupwererespectivelyhigherthaninI/R1groupandPost1group(P0.05)；comparingtheMDA,theI/R2groupandPost2groupwererespectivelylowerthaninI/R1groupandPost1group(P0.05).Intheshamgroup,therewaslowlevelapoptosis,whileinI/R1、I/R2、Post1、Post2groups，theapoptosiswereobviously.TheapoptosisindexinPost1groupandPost2groupwererespectivelylowerthaninI/R1andI/R2group(P0.05).TheapoptosisindexinI/R2groupandPost2groupwererespectivelylowerthaninI/R1andPost1group(P0.05).Conclusion(1)Theischemic/reperfusionofbraincouldinducebraincellapoptosis；(2)Postconditioningcouldinhibitbraincellapoptosisinducedbybrainsischemic/reperfusion；(3)Postconditioningcouldinhibitlipidperoxidationreactioninducedbybrainsischemic/reperfusion.【Keywords】ischemic/reperfusion；postconditioning；apoptosis；malonaldehyde；superoxidedismutase腦組織的缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷是一種常見的病理生理現(xiàn)象，多發(fā)生于顱腦手術(shù)、顱腦外傷、休克、頸動脈手術(shù)、以及腦血管病介入治療過程中。腦組織I/R損傷被認(rèn)為是影響腦組織缺血性疾病病人預(yù)后的重要原因，輕則影響功能，重則危及生命。因此，探尋防治腦組織的I/R損傷策略一直是近年來缺血再灌注研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。近年來，出現(xiàn)了一系列的方式方法來預(yù)防與治療I/R損傷，包括缺血預(yù)處理1、缺血后處理2、藥物預(yù)處理等。其中缺血后處理的腦保護(hù)機(jī)制研究的較少。本文通過將缺血后處理作用于I/R腦組織，通過檢測腦組織勻漿中丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、以及頂葉皮質(zhì)神經(jīng)元的凋亡來研究缺血后處理潛在的腦保護(hù)作用。材料與方法動物選擇與分組成年雄性SD大鼠40只（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所提供），體重250-300g，隨機(jī)分為5組（n=8），假手術(shù)組（sham組）：只進(jìn)行麻醉和分離解剖兩側(cè)頸總動脈，缺血再灌注1組（I/R1組）：給予腦缺血30min，再灌注24h，缺血再灌注2組（I/R2組）：給予腦缺血30min，再灌注48h，缺血后處理1組（Post1組）：給予腦缺血30min，缺血后處理后再灌注24h，缺血后處理2組（Post2組）：給予腦缺血30min，缺血后處理后再灌注48h。使用無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈實現(xiàn)腦缺血，撤去動脈夾實現(xiàn)再灌注。在再灌注即刻給予大鼠雙側(cè)頸總動脈松夾15s/夾閉15s，如此三次，實現(xiàn)缺血后處理。動物模型的制備大鼠術(shù)前12小時禁食，自由飲水。10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3ml/100mg）。頸部正中縱形切口，約2cm，分離淺、深筋膜及頸部肌群，暴露頸部正中氣管，在氣管背側(cè)左右兩側(cè)分離見血管神經(jīng)鞘，分離兩側(cè)頸總動脈及與之伴行神經(jīng)。用無創(chuàng)動脈夾夾閉兩側(cè)頸總動脈實現(xiàn)腦缺血，缺血30分鐘后，I/R1組、I/R2組撤去動脈夾實現(xiàn)再灌注，Post1組、Post2組撤去動脈夾恢復(fù)血流15秒后再行夾閉兩側(cè)頸總動脈再缺血15秒，如此三次，實現(xiàn)缺血后處理，其后行再灌注。以上各組均于實現(xiàn)再灌注后縫合頸部肌肉及皮膚，放回鼠籠飼養(yǎng)。I/R1組、Post1組和I/R2組、Post2組大鼠分別于再灌注24小時和48小時后處死取腦組織作細(xì)胞凋亡與MDA、SOD檢測。Sham組于分離出頸總動脈后30分鐘處死，開顱取腦作同上檢測。SOD活性、MDA含量、細(xì)胞凋亡的檢測在實驗設(shè)計的時間點(diǎn)開顱取大鼠腦組織，取左側(cè)半球腦組織頂葉皮質(zhì)制作勻漿并且離心取上清液，進(jìn)行SOD活性與MDA含量的檢測。SOD活性的測定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA含量的測定采用硫代巴比妥法。取右側(cè)半球腦組織用預(yù)冷的生理鹽水沖去殘血，置于10%的甲醛中固定做石蠟切片，進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。檢測方法采用改良的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的生物素脫氧尿嘧啶核苷酸缺口末端標(biāo)記法（terminaldeoxynucleotidyltransferasemediateduridinenucleotideendlabelling,TUNEL法）。于皮質(zhì)區(qū)光鏡觀察，隨機(jī)計算5個高倍視野下凋亡細(xì)胞數(shù)占神經(jīng)元總數(shù)的百分比，得細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptoticindex）。統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS15.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析：計量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（xs）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），均數(shù)間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls法進(jìn)行檢驗，P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果與sham組相比，I/R1組、I/R2組、Post1組、Post2組MDA含量增高，SOD活性降低（P0.05）；與I/R1組相比，Post1組MDA含量降低，SOD活性升高（P0.05）；與I/R2組相比，Post2組MDA含量降低，SOD活性升高（P0.05）；與I/R1組相比，I/R2組MDA含量降低，SOD活性升高（P0.05）；與Post1組相比，Post2組MDA含量降低，SOD活性升高(P0.05)。sham組可見少量凋亡細(xì)胞。與sham組相比，I/R1組、I/R2組、Post1組、Post2組凋亡指數(shù)升高（P0.05）；與I/R1組比較，Post1組凋亡指數(shù)降低（P0.05）；與I/R2組比較，Post2組凋亡指數(shù)降低（P0.05）；與I/R1組相比，I/R2組凋亡指數(shù)降低（P0.05）；與Post1組相比，Post2組凋亡指數(shù)降低（P0.05）。討論臨床上，缺血性腦血管病比較常見，造成腦組織血流量減少，導(dǎo)致缺血性損傷，而持久性缺血必然造成細(xì)胞壞死或者凋亡；及早恢復(fù)腦血流灌注尤為重要，但是再灌注具有雙重效應(yīng)：一方面，恢復(fù)血流灌注可以使缺血腦組織的功能結(jié)構(gòu)得到修復(fù)，緩解病情；另一方面，部分患者恢復(fù)血流灌注后缺血性損傷不但沒有得到緩解，缺血腦組織的代謝障礙、結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)一步加重，即所謂的腦缺血再灌注損傷。腦缺血動物模型：全腦缺血動物模型；局灶性腦缺血動物模型；不完全性全腦缺血動物模型3。本試驗基于試驗設(shè)計的特點(diǎn)，尤其是缺血后處理在麻醉領(lǐng)域中的應(yīng)用，不會涉及局灶性腦缺血。全腦缺血動物模型要么干擾其它器官組織的血流灌注，要么需要二期手術(shù)，成功率低，干擾因素較多，因此亦未選擇。不完全性腦缺血模型雖缺血不徹底，但是操作簡單，成功率高。另外，有試驗證實缺血30min即可對腦組織起到損傷作用，因此本試驗選擇了不完全性的全腦缺血動物模型。實驗觀察時間點(diǎn)的選擇：根據(jù)以往的試驗，不完全性腦缺血動物模型的缺血腦組織在再灌注后1h、3h細(xì)胞凋亡不明顯，6h后觀察到細(xì)胞凋亡持續(xù)增加，24h達(dá)高峰，其后細(xì)胞凋亡的水平開始降低。因此本試驗觀察細(xì)胞凋亡高峰時缺血后處理組與缺血再灌注組細(xì)胞凋亡的發(fā)生情況，以及再灌注后期即再灌注48h時后處理組與缺血再灌注組細(xì)胞凋亡的區(qū)別。實驗觀察部位的選擇：在缺血缺氧條件下，海馬CA1區(qū)、紋狀體、大腦皮質(zhì)等對缺血缺氧敏感的區(qū)域，易于發(fā)生細(xì)胞凋亡、程度也相對嚴(yán)重；而對缺血缺氧不太敏感的腦干等區(qū)域不易發(fā)生細(xì)胞凋亡，即使發(fā)生，程度也相對輕。因此，本試驗選取了大鼠大腦的頂葉皮質(zhì)作為細(xì)胞凋亡的觀察部位。缺血再灌注對腦組織的影響：大量的研究表明,腦組織的缺血再灌注引起氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、以及神經(jīng)元的凋亡?；钚匝酰╮eactiveoxygenspecies，ROS）在再灌注的最初幾分鐘內(nèi)爆發(fā)生成4，引發(fā)的氧化損傷是腦組織缺血再灌注損傷的主要原因之一。機(jī)體自身具有一整套完整的抗氧化酶系統(tǒng)，主要包括超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD），谷胱甘肽過氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-Px），過氧化氫酶（catalase，CAT）等。正常情況下，ROS可為上述抗氧化酶系統(tǒng)清除。在缺血再灌注過程中，體內(nèi)ROS大量生成，同時機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)功能下降，氧化能力大大超過抗氧化能力而發(fā)生氧化應(yīng)激，從而直接引起生物膜脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞內(nèi)蛋白及酶變性，DNA損害，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。通過減少ROS的產(chǎn)生和保護(hù)機(jī)體的抗氧化酶系統(tǒng)是抗腦組織缺血再灌注損傷的主要策略。神經(jīng)元凋亡是腦缺血再灌注損傷的重要形式之一5，特別在遲發(fā)性神經(jīng)元損害階段6。Li7等在局灶性和全腦缺血動物模型中觀察到了神經(jīng)元凋亡的現(xiàn)象。腦缺血時腦組織的血流量減少，腦組織嚴(yán)重缺氧，氧自由基清除酶的活性下降，氧自由基生成增多。腦組織由于含有大量不飽和脂肪酸，對氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)尤為敏感，因此腦神經(jīng)元細(xì)胞膜受到攻擊，產(chǎn)生大量過氧化脂質(zhì)，其中丙二醛（malonaldehyde，MDA）即為一種主要的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，它破壞細(xì)胞膜的通透性并導(dǎo)致一系列的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的損傷。MDA作為一種氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其含量變化間接反映了組織中氧自由基的含量與組織細(xì)胞的損傷程度。本實驗通過檢測腦組織勻漿中丙二醛含量反映腦組織缺血缺氧后脂質(zhì)過氧化水平。在對照組，MDA含量較低，而在I/R1組、I/R2組MDA含量較對照組顯著增高（P0.05）?？梢姡涸趯φ战M，腦組織脂質(zhì)過氧化水平較低，與組織中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化成分處于平衡狀態(tài)；缺血再灌注導(dǎo)致ROS的迅速大量產(chǎn)生，引起脂質(zhì)過氧化水平增強(qiáng)，氧化與抗氧化平衡被打破，偏向了過氧化一側(cè)，過氧化產(chǎn)物MDA增加，繼而產(chǎn)生一系列損傷。MDA在Post1組、Post2組的含量較對照組有顯著增高（P0.05）；但Post1組與I/R1組、Post2組與I/R2組相比，MDA的含量明顯的降低(P0.05)?？赡茉蚴牵喝毖筇幚硗ㄟ^再灌注開始階段控制性再灌注減弱了ROS的爆發(fā)產(chǎn)生，繼而減弱腦組織脂質(zhì)過氧化水平，起到了減輕組織損傷，改善預(yù)后的作用。I/R2組與I/R1組、Post2組與Post1組相比，MDA的含量均明顯的降低（P0.05），可以這樣解釋：機(jī)體在缺血缺氧引起脂質(zhì)過氧化情況下，通過調(diào)動機(jī)體內(nèi)源性機(jī)制，增加超氧化物歧化酶及谷胱甘肽等抗氧化物的產(chǎn)生及活性，對抗了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物MDA含量伴隨著時間推移而降低。因此，缺血后處理在一定程度上通過減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)起到腦組織的保護(hù)作用。SOD作為一種自由基清除劑，對機(jī)體的氧化抗氧化平衡起重要作用。正常狀態(tài)下，組織中具有一定水平的SOD，以對抗基礎(chǔ)狀態(tài)的脂質(zhì)過氧化，以達(dá)到氧化與抗氧化的平衡。本實驗檢測了各組大鼠腦組織中SOD活性，其中對照組SOD活性最高，I/R1組、I/R2組SOD活性較對照組明顯降低（P0.05）。可見：在對照組，氧化與抗氧化處于均勢，因而SOD具有高活性；缺血再灌注導(dǎo)致I/R1組、I/R2組脂質(zhì)過氧化水平的增強(qiáng)，在一定程度上消耗了組織的抗氧化儲備,因而SOD活性與對照組相比減低。在Post1組、Post2組，SOD活性與對照組相比明顯減低（P0.05）；但較I/R1組、I/R2組，SOD活性有所提高（P0.05）。可能原因：缺血后處理通過增強(qiáng)腦組織中SOD的活性，對抗組織過氧化反應(yīng)；或是減輕脂質(zhì)的過氧化，減少了自由基清除劑SOD消耗，實現(xiàn)了SOD的高活性，繼而發(fā)揮對抗過氧化反應(yīng)的良性循環(huán)作用，以發(fā)揮對組織器官的保護(hù)作用。I/R2組與I/R1組、Post2組與Post1組相比，SOD活性升高（P0.05），可以解釋為：機(jī)體調(diào)動內(nèi)源性的對抗脂質(zhì)過氧化的保護(hù)機(jī)制，通過增強(qiáng)SOD與過氧化氫酶的合成，使SOD活性隨著時間的推移得到了增強(qiáng)。因此：缺血后處理在一定程度上通過增強(qiáng)抗氧化物SOD的活性起到對腦組織的保護(hù)作用。缺血后處理減輕腦組織缺血再灌注導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化作用和減少超氧陰離子產(chǎn)生的可能機(jī)制：缺血后處理限制了底物氧分子的運(yùn)輸，因而直接的削弱了ROS的產(chǎn)生；缺血后處理延緩了細(xì)胞自身分泌的活性物質(zhì)如腺苷和一氧化氮的流出與釋放模式，從而減少了中性粒細(xì)胞或其它細(xì)胞來源的活性氧的產(chǎn)生8；缺血后處理使再灌注初期過度灌注時間縮短、流量減小，減少了活性氧簇的過度產(chǎn)生9。因此缺血后處理極可能是通過減輕再灌注早期ROS的產(chǎn)生，保護(hù)機(jī)體的抗氧化酶功能發(fā)揮抗缺血再灌注損傷的作用。本實驗檢測了各組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的發(fā)生情況：在sham組，細(xì)胞凋亡少量發(fā)生，在I/R1組、I/R2組細(xì)胞凋亡較sham組增強(qiáng)（P0.05）；在Post1組、Post2組細(xì)胞凋亡亦較sham組增強(qiáng)(P0.05)；但是Post1組與I/R1組、Post2組與I/R2組相比細(xì)胞凋亡降低(P0.05)。可見：生理狀態(tài)下存在細(xì)胞凋亡；缺血再灌注進(jìn)一步加劇了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，通過在再灌注的一開始給予缺血后處理，細(xì)胞凋亡水平較單純?nèi)毖俟嘧⒔M明顯降低。因此，缺血后處理可能是通過減少缺血缺氧組織的細(xì)胞凋亡發(fā)揮其保護(hù)作用的。Post2組較Post1組、I/R2組較I/R1組細(xì)胞凋亡的水平顯著的降低（P0.05）：可能源于缺血缺氧引起的腦皮質(zhì)神經(jīng)元的凋亡高峰出現(xiàn)于再灌注后24h，其后隨著時間的推移而減少。生物學(xué)機(jī)制為：單個細(xì)胞凋亡后相鄰的上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞可以吞噬凋亡小體，并在溶酶體中消化降解、細(xì)胞凋亡發(fā)生很快，持續(xù)2-4h10。細(xì)胞凋亡的機(jī)制為：在再灌注的早期階段，活性氧簇的過量產(chǎn)生觸發(fā)了位于線粒體內(nèi)膜的非特異性線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，導(dǎo)致了跨膜電位的消失，呼吸鏈的解偶聯(lián)，細(xì)胞色素C及其它促凋亡因子的外流，最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死或者凋亡。缺血后處理可能是通過抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放起到對抗缺血再灌注損傷的作用11。綜上所述，缺血后處理通過抑制腦組織的缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元胞凋亡以及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)起到對腦組織的保護(hù)作用?；谌毖筇幚砜梢栽谌毖l(fā)生后實施，不必像預(yù)處理那樣需預(yù)知缺血事件的發(fā)生，其在將來可能用于腦組織缺血再灌注損傷的保護(hù)過程中，起到改善預(yù)后的作用。參考文獻(xiàn)1MurryCE,JenningsRB,ReimerKA.Preconditioningwithischemia:adelayoflethalcellinjuryinischemicmyocardiumJ.Circulation,1986,74(5):1124-1136.2ZhaoH,SapolskyRM,SteinbergGK,etal.Interruptingreperfusionasastroketherapy:ischemicpostconditioningreducesinfarctsizeafterfocalischemicinratsJ.JCerebBloodFlowMetab,2006,26(9):1114-1121.3王軍，陳國華.大鼠腦缺血模型研究進(jìn)展J.中醫(yī)研究，2002，15（5）：60-61.4BeckerLB.Newconceptsinreactiveoxygenspeciesandcardiovascularreperfusionphysiology.CardiovascularResearch2004；61(3):461-470.5MattsonMP,DuanW,PedersenWA.Neurodegenerativedisordersandischemicbraindiseases.Apoptosis.2001；6:69-81.6NitatoraT,SatoN,WaguriS,etal.DelayedneuronaldeathintheCA1pyramidalcelllayerofthegerbilhippocampusfollowingtransientischemiaisapoptosisJ.JNeurosci,1995,15(2):1001.7LiY,ChoppM,JiangN,etal.InductionofDNAfragmentationafter10to120minutesoffocalcerebralischemiainratsJ.Stroke,1995,26(7):1252-1258.8KinH,ZhaoZQ,SunHY,etal.Postconditioningattenuatesmyocardialischemia-reperfusioninjurybyinhibitingev