第十章第十二章植物的人工種子

1、第十章第十二章植物的人工種子第一節(jié)第一節(jié) 人工種子的基本概念o人工種子人工種子（artificial seeds），又稱合成種子（synthetic seeds）、人造種子（manmade seeds）或無性種子（somatic seeds）。這一概念最初由Murashige（穆拉希格，1978）提出的。后來的科學(xué)家對這一概念下了各種定義，總之，（植物）人工種子的概念有狹義狹義和廣義之分。o1、從狹義上狹義上：o人工種子是指將植物離體培養(yǎng)中產(chǎn)生的胚狀體（主要指體細(xì)胞胚）包裹在含有養(yǎng)分和具有保護(hù)功能的物質(zhì)中形成的、并在適宜條件下能夠發(fā)芽出苗的顆粒體。o2、從廣義上：人工種子可包括以下幾種：o（1

2、）經(jīng)過或不經(jīng)過適應(yīng)干燥處理，不經(jīng)包裹成球，直接播種發(fā)芽的體細(xì)胞胚；o（2）用聚氧乙烯（polyox）等多聚物將多個體細(xì)胞胚包裹成的餅狀物；o（3）將體細(xì)胞胚混在膠中，用流質(zhì)播種法直接播種；o（4）用凝膠包裹頂芽、腋芽、小鱗莖等。o 為統(tǒng)一，現(xiàn)我們定義定義為：o 植物人工種子植物人工種子指用適當(dāng)?shù)姆椒ò３制饋淼?，能保存，運輸和供播種用的具有萌發(fā)力而成植株的胚狀體或芽等繁殖器官。第一節(jié)第一節(jié) 人工種子的基本概念類 型 胚 的 起 源 種 皮 胚乳與胚的接觸 天然種子 合子胚、不定胚 天然形成 生物學(xué)接觸 人工種子 不定胚（胚狀體）或頂芽、腋芽、小鱗莖等 人工制作 主要是物理接觸 第二節(jié)第二節(jié)

3、人工種子的應(yīng)用價值o 就目前所知，植物人工種子植物人工種子可具有如下優(yōu)點：o1、對自然條件中不結(jié)實的或種子很昂貴的某些植物進(jìn)行繁殖。o2、繁殖速度快，且制作不受季節(jié)影響。o3、用于“固定”雜種優(yōu)勢，使雜種一代（F1）可多代利用。o4、有利于節(jié)約糧食和種源o5、成為基因工程技術(shù)應(yīng)用到生產(chǎn)中的橋梁。o6、比天然種子具多功能性o7、可以保存及快速繁殖脫病毒苗，并避免脫毒苗的繁殖過程中重新受病毒的感染。o8、比普通試管苗成本低、運輸方便，減少玻璃化苗。o9、促進(jìn)對細(xì)胞分化，胚狀體及有性胚（合子胚）的生物學(xué)研究。第三節(jié)第三節(jié) 人工種子的制作o一、人工種子的類型o二、人工種子的制作過程第二節(jié)第二節(jié) 人工種

4、子的應(yīng)用價值o 由于人工種子人工種子具有以上這幾方面的優(yōu)點，因此，其應(yīng)用前景是誘人的，引起世界各國的重視。80年代初，美國美國（如加州的植物遺傳公司、植物DNA技術(shù)公司等）、日本日本、法國法國相繼開展了植物人工種子的研究，并初步在胡蘿卜、苜薯、芹菜、花椰菜、萵苣、花旗松等植物上制作人工種子成功。爾后，人工種子也納入了歐歐洲尤里卡洲尤里卡計劃，以法國法國為主，與瑞士瑞士、西班牙西班牙等國合作。芬蘭芬蘭、印度印度、南朝鮮南朝鮮等也在進(jìn)行研究。o 我國我國在“七五”期間，也開始將人工種子人工種子作為一種新的生物技術(shù)列入國家高技術(shù)發(fā)展計劃（863計劃），對胡蘿卜、番木瓜，橡膠樹等十幾種植物進(jìn)行了系統(tǒng)研

5、究，其中胡蘿卜、黃連、苜蓿等已得到大量的體細(xì)胞胚，制成的人工種子在無菌條件下可以轉(zhuǎn)換成苗。表明我國在這一領(lǐng)域中的研究已取得很大進(jìn)展。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前已有40多種植物已成功地制成人工種子，有的已開始應(yīng)用于生產(chǎn)。第三節(jié)第三節(jié) 人工種子的制作一一、人工種子的類型o 目前已制成的人工種子體系人工種子體系主要有兩種：帶有膠囊外殼（種皮、基質(zhì)）體系的人工種子和脫水人工種子。o 、膠囊外殼體系人工種子膠囊外殼體系人工種子o （）定義定義：這類人工種子是采用合適的膠（常用海藻酸鹽）將體細(xì)胞胚或芽包裹而成。o （）基本結(jié)構(gòu)：如圖所示第三節(jié)第三節(jié) 人工種子的制作一一、人工種子的類型o（3）優(yōu)點優(yōu)點與缺點缺點o

6、優(yōu)點優(yōu)點（4點）：o1）顆粒小（直徑約4mm）；o2）膠珠對體細(xì)胞胚有保護(hù)作用；o3）膠囊可作營養(yǎng)庫（人工胚乳）；o4）膠囊外有疏水性膜，可防膠囊破裂和失水，便于播種。o 缺點缺點（5點）：o1）大批制作人工膠囊在包封技術(shù)上還未能保證；o2）貯藏的膠囊胚存活率降低；（與呼吸作用受阻有關(guān)）o3）保水性差，營養(yǎng)易外滲，干燥后不易吸水回漲；o4）膠囊易粘連，發(fā)霉；o5）制作成本仍較高。第三節(jié)第三節(jié) 人工種子的制作一一、人工種子的類型o 2、脫水人工種子脫水人工種子 o 此類人工種子是在膠囊包裹法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。最早由Kitto(1981)和Janick(1982)采用聚氧乙烯（Polyox WS

7、R-N）包埋胡蘿卜體細(xì)胞胚狀體，自然干燥后形成片狀薄膜，重新吸水膨脹后即可播種。o 脫水人工種子脫水人工種子可克服含水膠囊人工種子的某些缺點，使于貯藏，無需膜套。o 采用何種類型的人工種子，應(yīng)根據(jù)植物的種類、體細(xì)胞胚質(zhì)量、膠的類別以及制作目的和需要來選擇。第三節(jié)第三節(jié) 人工種子的制作二二、人工種子的制作過程o （1）人工種子人工種子的制作和應(yīng)用程序制作和應(yīng)用程序如下圖所示：o 愈傷組織的誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)（最好在發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器中進(jìn)行）體細(xì)胞胚的同步化體細(xì)胞胚的分化體細(xì)胞胚的包裹包裹外膜貯藏發(fā)芽成苗試驗體細(xì)胞變異程序與農(nóng)藝研究。第三節(jié)第三節(jié) 人工種子的制作二二、人工種子的制作過程o（二）體細(xì)

8、胞胚人工種子體細(xì)胞胚人工種子的制作o 主要包括胚狀體的誘導(dǎo)和包裹制作兩大方面。o1、胚狀體胚狀體的誘導(dǎo)發(fā)生及篩選獲得o 目前能大量產(chǎn)生體細(xì)胞胚的植物約有43科，92屬，100余種。過去認(rèn)為誘導(dǎo)胚狀體比較困難的禾本科植物，如水稻、小麥、玉米、珍珠谷等植物，現(xiàn)在也都能通過離體培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體。雖然，在植物組織培養(yǎng)中，不少植物都可誘導(dǎo)胚狀體，但由于培養(yǎng)條件或植物激素的不適宜影響，常常使胚狀體的發(fā)生頻率很低，體積小，在發(fā)育上出現(xiàn)了子葉不對稱，子葉連合成喇叭狀，多子葉、子葉畸形、胚軸肥大肉質(zhì)化及體胚發(fā)育受抑制而中途停頓等。在培養(yǎng)中發(fā)生的這些現(xiàn)象，使體細(xì)胞胚不宜或未達(dá)到制造人工種子的質(zhì)量，而導(dǎo)致低的轉(zhuǎn)換率。

9、所以，體細(xì)胞胚的質(zhì)量是影響人工種子轉(zhuǎn)換率人工種子轉(zhuǎn)換率的一個重要的限制因素。第三節(jié)第三節(jié) 人工種子的制作二二、人工種子的制作過程o（1）人工種子人工種子對胚狀體胚狀體的要求o1）播種后能很快發(fā)芽出苗；o2）根與芽能幾乎同時生長；o3）下胚軸無膨大，無愈傷組織化；o4）同步化程度較高，大小基本一致，發(fā)芽生長整齊；o5）“種子”生活力強；（特別在不良環(huán)境中如低溫、干旱中存活力強）o6）發(fā)芽后幼苗形態(tài)與生長基本正常。o（2）影響胚狀體胚狀體誘導(dǎo)發(fā)生的因素o主要從材料材料的遺傳基因型、外植體外植體的來源和年齡、培養(yǎng)基培養(yǎng)基種類和成分及濃度（如對植物激素、含氮化合物、含鉀化合物、天然提取物等的使用）和培

10、養(yǎng)條件培養(yǎng)條件等方面進(jìn)行調(diào)控。第三節(jié)第三節(jié) 人工種子的制作二二、人工種子的制作過程o（3）人工種子胚狀體人工種子胚狀體獲得的關(guān)鍵環(huán)節(jié)o1）同步脫分化促進(jìn)細(xì)胞的同步分裂。o在外植體培養(yǎng)初期，可在培養(yǎng)基中加入DNA合成抑制劑，如五氨基尿密啶等，使細(xì)胞暫停DNA合成，然后又除去DNA合成抑制劑（換培養(yǎng)基，不加該劑即可），促使細(xì)胞同步分裂。o2）高質(zhì)量體細(xì)胞胚的獲得o可從幾方面采取措施：（調(diào)控作用）oa.生長素：主要為的適宜使用、濃度ob.氮的類型及用量：培養(yǎng)基中可加入24mg/l的甘氨酸或丙氨酸，特別是脯氨酸；o酪蛋白水解物（CH），400mg/loc.碳源：可用麥芽糖（催熟因子），一般培養(yǎng)基用蔗糖

11、。第三節(jié)第三節(jié) 人工種子的制作二二、人工種子的制作過程o3）分離篩選同步化的胚狀體胚狀體o通過分離篩選出同步化的胚狀體（把不同步化的胚狀體去除）。o常用的分離篩選方法有：oa.密度梯度離心法：（Fujimura和Komamine,1984）o含胚狀體懸浮液在離心機上進(jìn)行離心處理，分離出各種同步的胚狀體。ob.過濾分選法：（Warren和Fouler,1977）o用一定規(guī)格大小的過濾器或濾網(wǎng)或濾膜，對含胚狀體的懸浮液進(jìn)行過濾分選。oc.儀器分選法：（朱征等，1990）o用專門儀器分選大小胚狀體。o在上述分離篩選方法中，以過濾分選法比較實用、有效和簡捷。第三節(jié) 人工種子的制作二、人工種子的制作過程

12、o 2、人工種子的包膠制作o 胚狀體（或芽）需要用膠囊包裹制成人工種子。o （1）對膠囊的要求：o 膠囊相當(dāng)于自然種子的種皮和胚乳（即起保護(hù)作用又能提供營養(yǎng)），因此，對制作人工種子的膠囊有一定的要求（即需要具備一定的條件）（5點）：o 1）有保護(hù)作用：可保護(hù)被包裹的胚狀體免受外部傷害；o 2）種皮軟硬適中：既不能太堅硬（以有利于發(fā)芽破膠），又不能太脆弱（以便于保存，運輸），一般要求達(dá)到能承受顆的壓力。o 3）能保持氣體交換和適度水分：為胚狀體生存的必需，膠囊要有一定的通透性。o 4）有必需的營養(yǎng)：以保證胚狀體萌發(fā)和早期發(fā)育。第三節(jié)第三節(jié) 人工種子的制作二二、人工種子的制作過程o （2）包膠基質(zhì)

13、包膠基質(zhì)o 要達(dá)上述人工種子制作對膠囊的要求，首先要選擇好的包膠基質(zhì)。據(jù)對20多種高分子化合物和凝膠所作比較，以海藻酸鹽是目前所用的較為合適的包膠基質(zhì)。海藻酸鈉，它是一種從海藻（如褐藻）中提取的多糖。o （3）人工種皮人工種皮o 包膠基質(zhì)首先要起人工種皮作用，其次才是起“胚乳”作用。o 什么叫人工種皮？人工種皮是指胚狀體（或芽）以外的部分的統(tǒng)稱。o 以海藻酸鈉制作較為適宜。第三節(jié)第三節(jié) 人工種子的制作二二、人工種子的制作過程o （4）人工胚乳人工胚乳o 什么叫人工胚乳人工胚乳？在包裹基質(zhì)中附加入有關(guān)營養(yǎng)成分和其他成分即成“人工胚乳”。o 根據(jù)不同類型繁殖體而選定：（見下表1）附加成份繁 殖 體

14、干燥胚或芽休眠微塊莖、鱗莖含水胚狀體、不定芽水凝膠胚乳不需要有益或不需要需要種皮有益有益需要營養(yǎng)及激素有益不需要或有益需要除草劑有益有益有益干燥保護(hù)劑需要不需要不需要殺蟲劑需要需要需要殺菌劑需要需要需要有機氮吸附劑不需要不需要需要有益微生物有益有益有益表1 不同類型繁殖體可能附加的成分 植物名及繁殖體海藻酸鈉濃度培養(yǎng)基和蔗糖濃度激素濃度（mg/L）轉(zhuǎn)株率四會貢柑體細(xì)胞胚3%MT，4%GA1,IBA0.2530%70%（無菌）唐菖蒲小球莖4%5%1/2MS,1.5%IBA0.5,GA0.193%（有菌）熱帶蘭花球莖4%改良MSNAA1,BA0.295%（有菌）赤桉微芽 4%改良HNAA0.20.

15、58090（無菌）小麥體細(xì)胞胚6%1/4MSGA1,防腐劑20045%（有菌）IAA，活性炭表2 幾種植物人工種子的附加成分及轉(zhuǎn)株率 第四節(jié)第四節(jié) 人工種子的貯藏和萌發(fā)o 1、人工種子人工種子的貯藏方法貯藏方法o （1）低溫保存法：即在40（冰箱）下保存，大麥在6個月仍存活。不同植物時間不同。o （2）低溫和干燥或脫落酸（ABA）處理相結(jié)合法：o 即在40黑暗，ABA（10-7mol/L）條件下保存。o （3）低溫、干燥一液體石蠟結(jié)合法：o 即：干燥液體石蠟2保存4個月o 石蠟作用：減少水分蒸發(fā)。第四節(jié)第四節(jié) 人工種子的貯藏和萌發(fā)o 2、人工種子人工種子的播種播種與萌發(fā)成苗o 由人工種子轉(zhuǎn)換成

16、高質(zhì)量苗應(yīng)具有如下特征：o （1）苗具有2片以上葉的頂端分生組織；o （2）根具2cm以上的長度或根雖較短但具次生根；o （3）根與莖直接相通，沒有愈傷組織或下胚軸腫脹（肥大）現(xiàn)象；o （4）綠色植物具有正常的表型。凡具有多莖、發(fā)育受阻或白化植株等均不是高質(zhì)量苗。第五節(jié)第五節(jié) 人工種子中體細(xì)胞胚的變異o 目前研究主要為體細(xì)胞胚的子葉數(shù)目，如具單個、二個、三個、多個子葉。o 為減輕體細(xì)胞無性系變異的影響，目前已有研究采用頂芽、腋芽等繁殖器官制作人工種子。如桑樹芽人工種子已有成功報道（Bapat等，1987）。 第六節(jié)第六節(jié) 人工種子商品化生產(chǎn)的主要問題o 人工種子人工種子要進(jìn)行商品化生產(chǎn)商品化生

17、產(chǎn)，需要解決如下5個問題：o 1、生產(chǎn)高質(zhì)量的體細(xì)胞胚o 2、開發(fā)高質(zhì)量的包裹基質(zhì)（即“種皮”）o 3、研制適用于大規(guī)模制作人工種子的包膠裝置o 4、克服體細(xì)胞無性系的變異和大田播種人工種子的缺陷o 5、降低成本第六節(jié)第六節(jié) 人工種子商品化生產(chǎn)的主要問題o 1、生產(chǎn)高質(zhì)量的體細(xì)胞胚o 高質(zhì)量的體細(xì)胞胚，必須具備下列特征：o （1）形態(tài)與發(fā)芽（即具有根延長部分）與合子胚相似；o （2）具有能發(fā)育成葉片的頂端分生組織和能產(chǎn)生根的胚根分生組織；o （3）能產(chǎn)生與親本相似的健壯植株。o 2、開發(fā)高質(zhì)量的包裹基質(zhì)（即“種皮”）o 目前，海藻酸鹽所制成的“種皮”尚有許多缺點。尋找更合符理想的水凝膠，可在膠

18、囊的外表包裹一層具有能進(jìn)行氣體交換又能保持“種皮”水分與差分球粒間彼此不會粘連發(fā)發(fā)霉的蒲膜，即為高質(zhì)量的“種皮”。第六節(jié)第六節(jié) 人工種子商品化生產(chǎn)的主要問題o 3、研制適用于大規(guī)模制作人工種子的包膠裝置o 如付曉棣等（1990）自制的人工種子滴制儀，每小時可滴制10萬粒人工種子，效果頗好。o 4、克服體細(xì)胞無性系的變異和大田播種人工種子的缺陷o 植物組織培養(yǎng)過程中，體細(xì)胞變異現(xiàn)象是普遍存在的。采用體細(xì)胞胚制作人工種子應(yīng)避免變異發(fā)生。第六節(jié)第六節(jié) 人工種子商品化生產(chǎn)的主要問題o 人工種子苗農(nóng)藝性狀欠佳的原因：o （1）人工種子的體細(xì)胞胚原是由組織培養(yǎng)產(chǎn)生，需要一定時間才能很好地適應(yīng)試管外的自然環(huán)境；o （2）體細(xì)胞胚內(nèi)貯藏蛋白含量很少，能提供碳源和能源的養(yǎng)分更少，人人胚乳的養(yǎng)分不如天然種子的胚乳那么良好和充足；o （3）人工種皮易蒸發(fā)失水。第六節(jié)第六節(jié) 人工種子商品化生產(chǎn)的主要問題o 5、降低成本o 目前供試驗用制作的人工種子所需成本遠(yuǎn)比天然種子高。o 人工種子用于天然種子難繁殖成種子價格昂貴的植物是合算的。o 與一般試管苗相比，人工種子成本要低得多，因為它耗用培養(yǎng)基量少、體